双歧杆菌冻干菌粉制备过程中保护剂的研究

李德斌，赵敏

（东北林业大学，哈尔滨 150040）

双歧杆菌冻干菌粉制备过程中保护剂的研究

李德斌，赵敏

（东北林业大学，哈尔滨 150040）

对双歧杆菌真空冷冻干燥过程中使用的各种保护剂进行了研究，在各种保护剂中筛选出4种效果比较好的类型，配合成复合保护剂，在很大程度上提高了双歧杆菌在冻干过程中的活菌存活率，达到71.11%的存活率。最后还进行了常温和低温保存实验。

双歧杆菌；计数方法；保护剂

0 引 言

双歧杆菌（Bifidobacterium）最初是由法国巴斯德研究所的 Henry Tissier（1899年）从母乳喂养的婴儿粪便中分离得到的，具有较好的保健作用，是目前益生菌制品中非常重要的品种之一[1，2]。但现在市售的双歧杆菌活菌制品存在一个最为关键问题，就是产品在贮存和销售过程中活菌数量会大量下降，导致效用降低，不能达到预期的目的。真空冷冻干燥技术[3]是目前微生物菌种保藏的主要应用技术之一，当微生物通过冷冻过程时，其体内的水分快速蒸发掉，只保持最低的水分质量分数，使其生理活动降低到最低程度，以增加微生物的寿命，延长其保藏期。所以将双歧杆菌制成冻干的菌粉[4]，延长其保存时间，是目前生产上常用得手段之一。

在冻干工艺中，低温和水分蒸发会对双歧杆菌造成很大的伤害。如果直接冷冻双歧杆菌菌液，会使双歧杆菌的活菌数目大幅度下降。为了提高在冻干过程中双歧杆菌的存活率，向双歧杆菌菌液中加入保护剂是一种非常有效的方法。保护剂的种类有很多，一般用多羟基醇、多糖等物质。

1 试 验

1.1 材料

试验菌种：菌种编号为1.1852。

培养基：采用牛奶还原培养基和PTYG[5]培养基，其中PTYG作为菌种保存和计数培养基使用，有生成的菌落形态规整、易于生长等优点。

计数方法采用双层平板计数方法[6，7]。

1.2 单一保护剂

1.2.1 保护剂的选择与配置

选择乳糖、可溶性淀粉、甘油、谷氨酸、蔗糖、葡萄糖和海藻糖7种保护剂。首先将其配置成一定浓度的母液，备用。

1.2.2 单一保护剂的添加

（1）菌液的生产。用无菌的移液管将1 mL双歧杆菌菌液在无菌操作下，接入装有30 mL牛奶还原培养基中，接种量约为3%，然后放入厌氧箱内恒温培养32 h。

（2）保护剂的加入。将预先配好一定浓度的保护剂加入(见表1)到培养好的牛奶还原培养基中，混合均匀，同时用双层培养基计数法检验双歧杆菌菌液中双歧杆菌的活菌数[8]。

（3）预冻。提前将安培瓶刷洗干净，用报纸包好后在160℃下灭菌1 h。吸2 mL加好保护剂的双歧杆菌菌液注到无菌安培瓶中，在-20℃的冰箱中预冻。

（4）冻干。把预冻好的安培瓶放入超低温真空冷冻干燥机，到成为干粉状。

表1 单一保护剂的加入量及最终质量分数

（5）封口。将装有冷冻好的双歧杆菌干菌粉的安培瓶，用酒精喷灯把安培瓶瓶口的玻璃烧化封好。

（6）冷藏。安培瓶封好后，放入-50℃冰箱中冷藏，待测。

1.3 复合保护剂

根据试验结果，选择保护作用较好的葡萄糖、海藻糖和可溶性淀粉等来配置复合保护剂。

1.3.1 复合保护剂质量分数的选择

根据单一保护剂的作用效果来选择复合保护剂的种类及浓度，具体情况如表2。

表2 复合保护剂质量分数的选择情况

1.3.2 复合保护剂的添加

方法同单一保护剂的试验方法。

2 结果与分析

2.1 保护剂对活菌率的影响

通过测定双歧杆菌菌液在真空冻干干燥前后双歧杆菌活菌数目，来对比单一保护剂对双歧杆菌的保护作用，具体情况如表3所示。由表3中可以看出：

（1）本研究所采用的7种保护剂，共14种处理对双歧杆菌的冻干过程均有一定的保护作用。

表3 真空冷冻干燥前后双歧杆菌活菌数目对照

（2）在所有的保护剂及各种处理中，以葡萄糖（10%）作为保护剂时，活菌存活率（32.5%）最高，依次为谷氨酸（0.5%）、甘油（1%）、海藻糖（0.6%）、海藻糖（1.2%）、乳糖（1%）等。

（3）在双歧杆菌菌液中加入保护剂的14种处理中，活菌存活率最低的是加入蔗糖（4%），其活菌存活率是5.42%，它也要比空白（不加入任何保护剂）的活菌存活率（2.5%）高一倍左右。而活菌率最高(葡萄糖10%)是空白的活菌率的13倍左右。

复合保护剂对活菌率的影响如表4所示。

表4 复合保护剂对活菌率的影响

由表4中得到如下结论：

（1）复合保护剂与单一保护剂相比，具有明显的增强作用，可以显著提高双歧杆菌在真空冷冻干燥过程中的活菌存活率。

（2）这10种复合保护剂的处理中，以9号（甘油+葡萄糖+海藻糖）处理的活菌率最高，为71.11%；比单一保护剂处理时最好的保护效果（32.5%）提高近40个百分点；10号 （蔗糖+葡萄糖+海藻糖），活菌百分率是62.22%，也是比较理想的。最低的效果（12.00%）也比单一保护剂的最低效果（5.42%）提高2倍多。

2.2 常温下冻干菌粉的活菌率

含有双歧杆菌的生物制品的一个重要缺陷，就是常温保存时活菌数下降过快。所以测定双歧杆菌冻干菌粉在常温保存时，活菌数目的变化情况对产品具有重要的意义。选择具有代表性的4℃和25℃作为测定温度更具有普遍意义。

表5 常温保存对活菌数的影响

由表5可以看出：

（1）双歧杆菌冻干菌粉无论在4℃和25℃保存下，其活菌数目都会下降，但是在4℃保存下，下降的趋势比较缓慢，一般在10 d后下降一个数量级，而在25℃保存下，下降剧烈，5 d时测定其活菌数目时，就已经下降一个数量级；

（2）使用复合保护剂比使用单一保护剂的双歧杆菌冻干菌粉中的活菌数，在相同的条件下，要高很多。

（3）不添加保护剂时，25℃保存，在10 d左右双歧杆菌活菌数就已经微乎其微了，到第15 d时，就已经检测不到了；4℃保存略好，但也不过延长5 d而已。

（4）添加单一保护剂时，25℃保存，可以保持较高的活菌数到10 d左右，15 d后，含量急剧下降，甚至检测不到；4℃保存，可以顺延5 d。

（5）添加复合保护剂时，效果最好，4℃可以保持较高的活菌数到25 d左右；25℃下，也可以到15 d。

（6）添加保护剂虽然可以适当延长双歧杆菌冻干菌粉的保质期，但对于商业上的应用还是不够的，所以还应该采取一些适当措施来提高含有双歧杆菌的生物制品的保质期来提高产品的质量，如制成肠溶性微胶囊。

3 讨 论

双歧杆菌制品长期以来，一直难以克服的困难就是如何保持其具有较高的活菌数的问题。现在一般采用胶囊或者微胶囊后密封保存的方式[9]，而生产这些产品的基础就是生产出具有较高活菌数的冻干菌粉来。所以较好的冻干菌粉工艺是发展双歧杆菌制品的基础。本研究通过在双歧杆菌冻干过程中加入各种保护剂来提高双歧杆菌的存活率，从而生产出具有较高活菌数的双歧杆菌制品。在冻干过程中加入了常见的各种冻干保护剂，发现单一的保护剂的效果还是远远没有达到预期的效果，效率最好的葡萄糖（10%）也不过是32.5%，而通过加入多种保护剂，可以达到更好的效果，可以达到71.11%，这样就会更好地满足生产上的要求。

[1]丁可,余倩.双歧杆菌检测方法进展研究[J].现代预防医学,2004,31(5):723-727.

[2]李德斌，赵敏，张静.双歧杆菌与微生态制剂.中国微生态学杂志.2003,15（6），371～372.

[3]CARVALHO A S,SILVA J,HO P,et al.Survival of Freeze-Dried Lacto-Bacillus Plantarum and Lactobacillus rhamnosus during Storage in the Presence of Protectants[J].Biotechnology Letter,2002,24(19):1587-1591.

[4]邵伟,乐超银,熊译,等.双歧杆菌冻干粉制备工艺研究 [J].现代品科技,2008,21(4):54-56.

[5]杜连祥,赵征.乳酸菌及其发酵制品生产技术 [M].天津:科学技术出版社,1999.

[6]刘伟，李德斌，高利.双歧杆菌计数方法的研究[J].食品科技，2010,35(9):34-36.

[7]王立平.最大可能数法计数乳品中双歧杆菌数量的研究[J].食品科技，2011,36(5):260-2 63.

[8]许燕滨,谢光炎,杨汝德,等.双歧杆菌微胶囊热稳定性研究 [J].广东工业大学学报,2001,18(4):86-88.

[9]PICOT A,LACROIX C.Effects of Micronization on Viability and Thermotolerance of Probiotic Freeze-Dried Cultures[J].International Dairy Journal,2003,13(6):455-462.

Study on protectant of freeze-drying Bifidobacterium powder in the preparation process

LI De-bin，ZHAO Min
(Northeast Forestry University,Harbin 150040，China)

All kinds of protectants were studied under the freeze-dry condition and four types of protectants,which have good effect,were screened out.The four protectants were mixed together forming the multiplex-protectant which can promotes the survival probability of bifidobnacterium on the process of freeze-dry greatly,the survival rate reached 71.11%.Finally,also carried out at room temperature and cold storage experiments.

Bifidobacterium;count method;protectant

Q93-335

A

1001-2230（2011）11-0032-03

2011-07-01

李德斌（1976-），男，工程师，从事微生物应用方面研究。