产细菌素乳酸菌的筛选及其纯化和稳定性研究

陈 沛，王雪青，阮海华

（天津商业大学a.天津市食品与生物技术重点实验室，b.物技术与食品科学学院，天津 300134）

产细菌素乳酸菌的筛选及其纯化和稳定性研究

陈 沛，王雪青，阮海华

（天津商业大学a.天津市食品与生物技术重点实验室，b.物技术与食品科学学院，天津 300134）

以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、单增李斯特菌、枯草芽孢杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌为指示菌，从30个健康婴儿的粪便中筛选得到1株具有广谱抑菌作用的菌株，经鉴定为乳酸乳球菌（编号F－6－B）.该菌株的培养条件为：MRS培养基起始pH 6.0，30℃静置培养48h.将其发酵液经硫酸铵沉淀，Hitrap SPHP（GE）阳离子交换柱层析后，得到的样品通过Tricine－SDS－PAGE为一条带，相对分子质量为3 300～5 800之间.经不同酸、热处理，该细菌素仍具有较好的抑菌活性，表现出较好的热稳定性和广谱的活性pH值范围，对胰蛋白酶处理敏感性差.

细菌素；乳酸菌；抑菌作用

细菌素（Bacteriocin）是由某些细菌在代谢过程中产生的一类具有抑菌作用的蛋白质或多肽，常表现为对同种或近源菌种有特异性的抑制作用［1］，而具有广谱抑菌作用的细菌素很少见.乳酸菌在利用乳糖或葡萄糖的代谢过程中，伴随乳酸发酵，可产生很多物质，如有机酸、过氧化氢和细菌素等，具有抑制腐败菌生长的特点，是健康人和动物肠道的优势菌群之一，对于维持肠道微环境的稳定与健康发挥着重要的作用［2－3］.肠内乳酸菌种植种群与健康长寿有着非常密切的关系.乳酸细菌素抑菌谱与产生菌密切相关，现已发现的乳酸菌细菌素有40余种，但广泛应用的只有乳酸链球菌素（Nisin），因此研发具有广谱抗菌作用的新型乳酸菌细菌素具有十分重要的意义.

乳酸菌在自然界中分布很广，在其生长过程中，除了产生乳酸之外，还产生一些其他的抗菌物质，可以抑制肠道腐败菌的繁殖，起到延缓衰老、抗肿瘤、降血脂、降胆固醇、增强免疫力等保健功能，被世界上公认为安全的食品级微生物.人体肠道内拥有乳酸菌的数量，随着人年龄的增长会逐渐减少，当人到老年或生病时，乳酸菌数量可能下降100至1 000倍，直到老年人临终时完全消失.因此，婴儿粪便中的乳酸菌，无论是数量还是种属，都占据十分重要的优 势 地 位.国 内 外 学 者 陆 续 从 泡 菜［5－6］、奶 制品［7－8］、肉制品［9－10］等食品中发现产细菌素的乳酸菌，但从粪便中筛选还很少见，本研究将从婴儿粪便中发现新的细菌素.

利用乳酸菌鉴别培养基对来自30个健康婴儿粪便样品进行初筛，并通过抑菌圈实验对初筛得到的60个乳酸菌复筛，对得到的阳性菌株的生长特性及其产细菌素进行了分离纯化，并对其热、酸、碱稳定性和酶的敏感性进行了系列研究，旨在研发新的细菌素.

1 实验

1.1 材料

实验菌种：大肠杆菌（Escherichiacoli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、藤黄微球菌（Micrococcusluteus）、单增李斯特菌（Listera）、枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）、志贺氏菌（shigella）、沙门氏菌（salmonella），均来自天津商业大学微生物教研室.

培养基［4］：MRS培养基、LB培养基、CM502培养基，溴钾酚紫MRS鉴定培养基.

1.2 实验方法

1.2.1 产细菌素乳酸菌株的分离

将采集到的婴儿粪便用生理盐水进行10倍递增稀释，得到稀释度分别为 10－1，10－2，10－3，10－4，10－5，10－6的样品，并将其均匀地涂布于含有0.02g／mL CaCO3的 MRS平板上，于30℃培养48 h，挑取有溶钙圈的单菌落于含有溴钾酚紫的MRS培养基划线分离，反复纯化.挑取单菌落进行革兰氏染色，镜检，观察乳酸菌的形态及颜色是否一致.

1.2.2 抑菌试验

采用抑菌圈实验法［2］.具体操作如下：将过夜培养的指示菌培养液的光密度值 （OD600）调至0.1，作为指示菌工作液，取出100μL均匀涂布于LB平板上（李斯特菌涂于CM502平板上）.乳酸菌以体积分数为1%的接种量接种到5mL MRS液体培养基中，将各供试菌株连续培养3代，30℃ 培养48h，4℃ 离心15min，取上清液用0.22μm滤膜过滤.用1mol／L NaOH将过滤后的上清的pH值调至7.0.将牛津杯均匀放于涂好指示菌的平板表面，吸取100μL制备好的发酵液加入牛津杯中，37℃培养过夜，观察抑菌圈直径.选取有抑菌圈的发酵液进行复筛，用体积分数为85%的硫酸铵对发酵液上清进行硫酸铵沉淀，用pH 6.0的20mmol／L乙酸钠将沉淀复溶后，进行抑菌试验，有抑菌圈的即为目的菌株.

1.2.3 生物学特性的研究

1.2.3.1 细菌素的热稳定性

将过滤除菌的发酵液上清分别用70℃，100℃处理30min，25℃，70℃，90℃，100℃处理1 h，121℃处理15min，以金黄色葡萄球菌为指示菌，选用未经处理的发酵液为阳性对照，而MRS培养基为空白对照，进行抑菌实验，以抑菌圈直径的大小反映该细菌素的热稳定性.

1.2.3.2 细菌素的酸碱稳定性

将过滤除菌的发酵液上清分成不同组，分别用1mol／L NaOH，1mol／L HCl调至不同的pH（pH 2.0，pH 3.0，pH 4.0，pH 5.0，pH 6.0，pH 7.0，pH8.0，pH 9.0，pH 10.0，pH 11.0，pH 12.0），于25℃处理2h，以金黄色葡萄球菌为指示菌，以未经处理的发酵液为阳性对照，MRS培养基为空白对照，以抑菌圈直径的大小反映该细菌素的酸碱稳定性.

1.2.3.3 细菌素对胰蛋白酶的敏感性

用5mg／mL胰蛋白酶对发酵液处理2h，以金黄色葡萄球菌为指示菌，以未经处理的发酵液为阳性对照，MRS培养基为空白对照，以抑菌圈直径的大小反映该细菌素对胰蛋白酶的敏感性.

1.2.4 细菌素的分离纯化

将乳酸菌以体积分数为1%的接种量接种到1LMRS液体培养基中，30℃ 培养48h，4℃，以4 000r／min离心15min，上清液用0.22μm膜过滤除菌，对发酵上清液用体积分数为60%的硫酸铵沉淀.再以16 000r／min于4℃的条件下离心10min，弃上清，留沉淀.将沉淀溶于1LpH 6.0的20mmol／L乙酸钠溶液中并经过用乙酸钠平衡好的Hitrap SP HP（GE）阳离子交换柱分离，用pH 6.0的20mmol／L 乙酸钠与含有 500mmol／L NaCl的pH 6.0，20mmol／L乙酸钠进行梯度混合洗脱.收集样品，进行抑菌试验.

1.2.5 乳酸菌细菌素产生菌株的筛选

对采集到的样品经10倍递增稀释，涂布于乳酸菌鉴别培养基，于30℃培养48h，挑取有溶钙圈的单菌进行反复纯化.将分离得到的乳酸菌接种于5 mL的液体MRS培养基，30℃培养过夜后，除去菌体，将发酵液上清调pH值至7.0，进行初筛抑菌实验.将初筛有抑菌圈的菌株进行复筛.复筛用质量分数为85%的硫酸铵进行沉淀，沉淀后得到一株具有广谱抑菌活性的菌株，编号为F－6－B.

2 结果与讨论

2.1 F－6－B的胰蛋白酶敏感性

将F－6－B经胰蛋白酶处理，以未经 MRS培养基处理的样品为对照，检测抑菌活性结果见表1.从表1可看出，F－6－B所产生的细菌素有着与Nisin相似的抑菌活性，即对胰蛋白酶不敏感.

表1 胰蛋白酶水解处理对细菌素抑菌活性的影响Table 1 Effect of trypsin hydrolysis treatment on bacteriocins antibacterial activity

2.2 菌株的形态学特征鉴定

F－6－B经革兰氏染色和镜检鉴定为革兰氏阳性球菌，短链，无芽孢、鞭毛、荚膜.在 MRS平板上生长呈圆形、直径约1.2mm、乳白色、低凸起、边缘整齐、不透明的光滑型菌落，初步鉴定为乳酸乳球菌.

2.3 细菌素的生物学特性

2.3.1 温度对细菌素活性的影响

按照1.2.3.1实验方法所做结果见表2.从表2可以看出，该细菌素对热有很好的稳定性，用121℃处理15min后仍然具有抑菌活性.

表2 热处理对细菌素抑菌活性的影响Table 2 Effect of heat treatment on bacteriocins antibacterial activity

2.3.2 酸碱度对细菌素抑菌活性的影响

用1mol／L HCl，1mol／L NaOH 将F－6－B菌株发酵离心上清液分别调至不同的pH值，并在25℃下水浴2h后再调回对照pH7.0.以未经处理的发酵液对照，检测抑菌活性，结果见图1.从图1可以看出，当发酵液的pH值为2.0～7.0时，细菌素的抑菌活性随着酸性的减弱而增大；但当pH值＞7.0时，细菌素的抑菌活性开始缓慢下降，至pH值 ＞10.0后，抑菌活性急剧下降.因此该细菌素在碱性条件下不稳定，随着碱性的增加，其抑菌活性会减少，而在中、酸性条件下则表现有较好的稳定性.

图1 酸碱度对细菌素稳定性的影响Figure 1 Influence of pH.value on bacteriocins stability

2.3.3 细菌素在不同pH条件下的热稳定性

将F－6－B菌株发酵离心上清液分别调至pH值为2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，分别于25℃，70℃，90℃，100℃，121℃温度下处理不同的时间，之后再回调至中性环境，以未经处理的原液作为对照，检测抑菌活性，结果见表3.

表3 细菌素在不同pH条件下的热稳定性Table 3 Inhibitory activities of bacteriocin at different temperatures

从表3可以看出，细菌素在酸性条件下有很好的热稳定性，经121℃处理15min后仍然有抑菌活性.而当pH值大于7.0时热稳定性随着pH值的增大而逐渐减弱，当pH值为10.0时，仅在70℃下处理30min，便观察不到抑菌圈.

2.4 细菌素的分离纯化

将细菌素的发酵液上清经过质量分数为60%的硫酸铵沉淀，Hitrap SP HP（GE）阳离子交换柱层析收集到的样品，经电泳鉴定为一条带，该细菌素的相对分子质量为3.3×103～5.8×103.结果见图2.

图2 细菌素纯化后电泳图Figure 2 Tricine－SDS－PAGE of bacteriocins purified by Hitvap SPHP（GE）

3 结论

利用从30个健康婴儿中分离得到的一株产广谱细菌素的乳酸菌（F－6－B），通过排除发酵液上清中有机酸和过氧化氢的影响，初步证明F－6－B产生的是一种细菌素，该细菌素的抑菌活性与Nisin相似.

对该乳酸菌产生的细菌素进行了初步研究.将分离得到的乳酸乳球菌进行30℃，48h培养后，对其进行分离纯化，相对分子质量在3 300～5 800.同时对细菌素进行耐酸碱，热稳定以及蛋白酶敏感等实验，发现该细菌素在酸碱环境下均具有很强的抑菌作用和很好的热稳定性，即使在121℃加热15min的条件下，仍有抑菌活性，并且表现对胰蛋白酶不敏感.与目前在食品加工中广泛使用的Nisin相比，由于其较好的热稳定性和酸碱稳定性，使其具有更好的加工特性，预示着该细菌素在食品生物防腐剂等方面，具有潜在应用价值.

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Screening bacteriocin－producing lactic acid bacteria and purification of bacteriocin and its stability

CHENPei，WANGXueqing，RUANHaihua
（a.Tianjin Key Laboratory of Food and Biotechnogy，b.College of Biotechnology and Food Science，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China）

One strain of bacteriocin－producing bacterium was isolated from feces of 30healthy infants，usingEscherichiacoli，salmonellasMicrococcusLuteusListera，bacillussubtilis，shigella，Staphylococcusaureusas indicate germs，and was identified asLactococcusschleifer（number F－6－B）.The bacteriocin was obtained from the fermentation broth of culture by ammonium sulfate precipitation and ion－exchange chromatography of Hitrap SPHP（GE）.The molecular weight of the bacteriocin was 3 300－5 800that determined by Tricine－SDS－PAGE.Treated with acid，heat and enzyme，the bacteriocin still had significant effects on bacteriostasis，exhibiting its better thermostability，a broad－spectrum pH range of activity and poor sensitivity to trypsin.

bacteriocin；lactic acid bacteria；antibacterial ability

Q936

A

1671－1114（2011）02－0082－04

2010－04－25

天津市科委应用基础重点资助项目（08JCZDJC16600）；国家科技部资助项目（2008BAD94B09）

陈 沛（1986—），女，硕士研究生.

王雪青（1964—），女，博士，教授，主要从事生物活性物质方面的研究.

（责任编校 纪翠荣）