基于 ISSR标记的黄河下游区域鲁桑地方品种遗传关系分析

张 林,黄 勇,沈兴家,刘 利,赵卫国,强 胜

(1.南京农业大学生命科学学院杂草研究室,江苏 南京 210095；2.中国农业科学院蚕业研究所,江苏 镇江 212018；

3.江苏科技大学生物与环境工程学院,江苏 镇江 212018；4.国家农业部蚕桑遗传改良重点开放实验室,江苏 镇江 212018)

在中国,桑 (MorusalbaL.)的栽培历史悠久,遗传资源十分丰富。根据地理分布可将中国桑地方品种分为 8个不同的生态类型,每个生态类型均有各自的特征,在枝条形态、叶形大小、发芽期、抗逆性等方面都有一定的差异。黄河下游区域栽培的鲁桑〔Morusalbavar.multicaulis(Perro tt.)Loud.〕是 8个生态类型之一,是中国北方主蚕区的代表性桑品种,也是中国桑品种资源库的重要组成部分[1-2],主要分布在山东省蚕区,也包括河北省的部分蚕区。

ISSR分子标记具有简单和重复性好的优点,已广泛应用于桑树的分子生物学研究。其原理是根据植物中广泛存在简单重复序列(SSR)的特点,利用在植物基因组中常出现的 SSR本身设计引物,用于扩增的引物通常具有 16～18个碱基,一般由 1～4个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成,无需预先克隆和测序。目前已广泛应用于植物品种鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样性、进化及分子生态学研究中。

目前,有关桑树 ISSR分子标记的研究较多,研究方向主要集中于桑树遗传多样性和亲缘关系方面,研究对象主要是不同品种以及不同生态类型。V ijayan等[3-5]采用 ISSR分子标记对印度的桑属 (MorusL.)栽培品种、高产品种及野生种进行了遗传多样性分析；Awasthi等[6]采用 ISSR分子标记对桑树的部分栽培品种进行了亲缘关系分析,研究结果显示品种间差异明显；赵卫国等[7-14]利用 ISSR分子标记对桑树的栽培种和野生种、二倍体、同源四倍体、选育品种、芽变类型以及 8个不同生态类型进行了遗传多样性分析及分子系统学研究；Kar等[15]利用与某些生化性状有关的 ISSR标记分析了印度桑树遗传资源的遗传变异和亲缘关系。但迄今为止,对桑树同一生态类型不同地方品种间亲缘关系的研究却较少,对鲁桑地方品种遗传多样性的研究则未见报道。

作者利用 ISSR分子标记技术对黄河下游区域(河北省和山东省)46个鲁桑地方品种的遗传多样性进行了分析,以期在分子水平上研究鲁桑不同地方品种的遗传关系,为鲁桑种质资源DNA指纹图谱的建立及品种鉴定提供科学依据。这对于鲁桑种质资源的保护、重要农艺性状基因的发掘和利用都具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 材料

供试的 46个鲁桑地方品种均种植于江苏镇江的国家桑树资源圃,原产地及各地方品种的主要性状见表 1。采集当年生嫩叶供试。

实验使用的 ISSR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,TaqDNA聚合酶、PCR buffer、dNTPs以及 DL2000 m arker均购自宝生物工程 (大连)有限公司。

1.2 方法

随机采集各地方品种当年生新鲜嫩叶,用 CTAB法[16]提取总DNA,并置于 -70℃条件下保存、备用。用鲁桑品种‘大鸡冠’的总DNA对23个 ISSR引物进行初步筛选,选择扩增条带清晰、多态性高、重复性好且扩增结果稳定的 15个引物,用于 46个鲁桑地方品种总DNA的 ISSR扩增反应。

ISSR-PCR反应体系总体积为 15μL,包括 10 ng模板 DNA、0.7μL引物 (10 ng·μL-1)、1 UTaqDNA聚合酶、1.5μL 10×PCR buffer和 0.25μLdNTPs(200μmo l·L-1),用纯水补足至 15μL。

ISSR-PCR扩增程序为：94℃预变性 2 m in；然后于 94℃变性 40 s、40℃～60℃退火 45 s(根据每个引物的 Tm值设定具体退火温度)、72℃延伸90 s,共 36个循环反应；最后于 72℃延伸 7m in。扩增产物置于4℃条件下保存。

ISSR-PCR扩增产物通过用质量体积分数 1％的琼脂糖凝胶(含质量浓度 0.5μg·mL-1EB)进行电泳检测,并对电泳结果进行拍照记录。

表 1 供试 46个鲁桑地方品种的原产地及主要性状Tab le 1 The or ig in sand m a in characters of for ty-six loca l var ieties of M o rus a lba var.m u lticau lis(Perrott.)L oud.for tested

1.3 数据分析

按照清晰易辨、重复、稳定的原则对扩增条带进行统计,有条带的记为“1”、同一位置没有条带的则记为“0”,以此形成 0、1数据矩阵。统计每个引物扩增出的条带数和其中的多态性条带数,并计算多态性条带百分率。按照 Nei等[17]的方法,利用 Popgene 3.0 (PHYL IP 3.5版本)系统分析软件计算各地方品种间的遗传相似系数和遗传距离,并采用类平均数聚类方法(UPGMA)进行聚类分析,构建鲁桑地方品种间的遗传关系树状图。

2 结果和分析

2.1 ISSR扩增结果

经过初筛实验,从 23个 ISSR引物中筛选出扩增条带清晰、多态性高、重复性好且扩增结果稳定的 15个引物用于 46个鲁桑地方品种指纹图谱的构建和遗传多样性分析,引物序列和扩增结果见表 2,引物ISSR04的扩增图谱见图 1。

由表 2可见,在筛选出的 15个引物中,12个引物(ISSR03～ISSR07和 ISSR09～ISSR15)含有 2个碱基的微卫星重复单位,2个引物 (ISSR02和 ISSR08)含有 3个碱基的微卫星重复单位,1个引物 (ISSR01)含有 4个碱基的微卫星重复单位。通过 PCR反应,共扩增出 109条清晰条带,其中多态性条带 81条,多态性条带百分率为 74.31％,平均每个引物扩增的条带数为 7.3条,平均每个引物扩增的多态性条带数为 5.4条。不同引物扩增的条带数为 5～11条,引物 ISSR11扩增出的条带数最少,仅有 5条；引物 ISSR05扩增出的条带数最多,为 11条。各引物扩增出的片段大小为 250～2 000 bp(图 1)。

表2 用于46个鲁桑地方品种总DNA ISSR标记分析的引物序列及扩增结果Tab le 2 Pr im er sequence and am p lifica tion resu lts of ISSR m arker ana lysis of tota l DNA from for ty-six loca l var ieties of M o rus a lba var. m u lticau lis(Perrott.)Loud.

2.2 基于 ISSR标记的聚类分析结果

以 46个鲁桑地方品种总DNA的 ISSR-PCR扩增反应产生的 81条多态性条带为基础数据,计算各地方品种间的遗传相似系数,结果表明,46个地方品种间的遗传相似系数变异范围为 0.602～0.898,平均遗传相似系数为 0.750。由于实验所涉及的鲁桑地方品种均为山东省和河北省典型的地方品种,这 2个省份毗邻且不排除相互引种的可能性,因此,计算出的平均遗传相似系数相对偏大。其中,品种‘莱芜接桑’和‘梧桐桑’以及品种‘小鸡冠’和‘三岔黄鲁’间的遗传相似系数最大,为 0.898,表明它们之间的遗传距离最小,亲缘关系很近；来源于河北的品种‘冀丰’和山东的品种‘新泰打桑’的遗传相似系数最小,仅为0.602,表明二者间的遗传距离最大,亲缘关系最远。

基于鲁桑不同地方品种间的遗传相似系数、采用UPGMA法进行了聚类分析,结果见图 2。由图 2可见,在遗传相似系数约 0.637处,供试的 46个鲁桑地方品种 (40个为山东地方品种,6个为河北地方品种)被划分成 2大类。其中,品种‘冀丰’和‘冀黄鲁选’为河北省地方品种,且均为雌株,被聚在一起成为第 1大类；其余 44个地方品种聚为第 2大类,该大类包括 40个来自山东省的鲁桑地方品种和 4个来自河北省的鲁桑地方品种。综合各地方品种的产地、性状及遗传相似性系数,可进一步将第 2大类的 44个地方品种细分为9个亚类,分别为A、B、C、D、E、F、G、H和 I亚类。其中,A、E、F、G、H和 I亚类共包含了36个地方品种,全部为原产山东省的鲁桑地方品种,占供试的山东鲁桑地方品种数(40个)的 90％；划归B、C和D亚类的地方品种均包含了分别来自山东省和河北省的地方品种,其中,B亚类包含了来自河北深县的品种‘碗桑’和来自山东蒙阴的品种‘红条擗桑’,C亚类包含了来自河北宽城的品种‘桲椤桑’、来自河北深县的品种‘深县黄鲁’和来自山东青州的品种‘益都大白条’,D亚类包含了来自河北深县的品种‘大碗桑’以及来自山东临朐的品种‘选 792’和‘黄鲁头’；此外,E亚类较为特殊,仅包含 1个品种,即产自山东蒙阴的品种‘白条擗桑’,是 46个供试品种中惟一的 1个三倍体品种,在遗传特性上具有明显的特殊性。

图1 引物 ISSR04对46个鲁桑地方品种总DNA的 ISSR扩增图谱Fig.1 ISSR am p lifica tion pa ttern of tota lDNA from for ty-six loca l var ietiesofM o rus a lba var.m u lticau lis(Perrott.)Loud.am p lified by pr im er ISSR04

图2 基于46个鲁桑地方品种总DNA ISSR标记分析的 UPGM A聚类图F ig.2 UPGM A cluster dendrogram based on ISSRm arker ana lysis of tota lDNA from for ty-six loca l var ieties of M o rus a lba var.m u lticau lis(Perrott.)Loud.

3 讨论和结论

买买提依明等[18]对 16个新疆地方桑树品种资源(包括 2个引进的品种)进行了 RAPD标记研究,发现新疆特有的桑树品种资源药桑与引进的品种‘西庆1号’和‘西庆 2号’间的指纹图谱差异较大,表明不同桑树地方品种的遗传关系与其地理分布具有一定的相关性。在本研究中,利用 ISSR分子标记对 46个鲁桑地方品种进行进一步的划分,结果显示,鲁桑地方品种的各大类和各亚类与各地方品种的地理分布具有一定的关系,地理位置相近的品种遗传相似系数较大,一般被聚在一起。例如,来自山东各地的 40个鲁桑地方品种均被聚入第 2大类中,形态特征相似的鲁桑地方品种聚为同一个亚类,且很多来自同一个县。其中,A亚类中的‘大鸡冠’和‘小鸡冠’都为来自山东临朐的鲁桑地方品种,均为雌雄同株；D亚类中的‘选 792’和‘黄鲁头’以及 G亚类中的‘鸡冠一生子’和‘黑鲁桑’也都为来自山东临朐的鲁桑地方品种,且形态特征相似；I亚类中的‘小黄桑’和‘新泰打桑’也均为来自山东新泰的鲁桑地方品种。但B、C和D亚类分别由来自山东和河北的鲁桑地方品种组成,这一现象很可能与不同产地间的相互引种有关。

使用 15个 ISSR引物对 46个来自山东和河北的鲁桑地方品种总DNA进行扩增反应,共扩增出 81条多态性条带,多态性条带百分率为 74.31％,说明供试的鲁桑地方品种间具有丰富的遗传多样性。46个鲁桑地方品种间的遗传相似系数为 0.602～0.898,数值偏大,这可能是由于河北和山东两省距离较近,且可能存在相互引种的现象。基于 ISSR分子标记对供试的 46个鲁桑地方品种进行聚类分析,获得的分组结果与不同品种的地理分布有一定的相关性,说明鲁桑地方品种间的亲缘关系与地理分布的远近有关。

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