人载脂蛋白A5单抗制备及临床应用的研究

焦娟 赵满仓 魏文青 刘晶 张艳 付瑶

·论著·

人载脂蛋白A5单抗制备及临床应用的研究

焦娟 赵满仓 魏文青 刘晶 张艳 付瑶

目的制备抗人载脂蛋白A5(ApoA5)单克隆抗体(McAb)，建立ELISA双抗体夹心法，并进行初步的临床应用。方法利用合成的人ApoA5抗原免疫BALB/c小鼠，制备McAb，并对抗体的效价、特异性、亚类及位点进行了测定，建立了ELISA双抗体夹心法，测定了正常对照组(145例)和冠心病组(68例)血清中ApoA5的含量。结果获得了5个稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株，且均为IgG2a型。腹水效价达到1.6×105。冠心病组胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和ApoB水平明显高于对照组(P<0.05)，而高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)、ApoA1和ApoA5水平明显低于对照组(P< 0.05)。ApoA5与HDL-C、ApoA1水平呈正相关(r值分别为0.53和0.63，P<0.05)，与TC、TG、LDL-C、ApoB呈负相关(r分别为－0.69、－0.63、和－0.59，P<0.05)。结论ApoA5参与脂质代谢，对于心血管疾病的预防和治疗具有一定的临床意义。

载脂蛋白A类;抗体，单克隆;血脂;冠心病

载脂蛋白A5(apolipoprotein A5，ApoA5)是由Vander等［1，2］在2001年同期发现并证实的一个载脂蛋白家族新成员，其参与调节血脂代谢，尤其与三酰甘油(TG)关系密切，是与血浆TG水平呈负相关的载脂蛋白。血浆TG水平升高是动脉粥样硬化和冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)的重要危险因素，高TG血症已被列为冠心病的独立危险因子。探讨ApoA5与高脂血症的相互关系，对于心血管疾病的预防和治疗具有重要的理论和实际意义。我们利用生物技术合成ApoA5，偶联载体蛋白制成抗原，免疫BALB/c小鼠，制备抗人ApoA5单克隆抗体。建立ApoA5－ELISA双抗体夹心法，对实验条件和影响因素进行了探索，并初步应用于临床检测。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2007年9月至2008年11月门诊体正常人145例作为正常对照组，男87例，女58例;年龄38～78岁，平均年龄60岁。选择同期我院心内科确诊的冠心病的患者68例(参考1979年WHO诊断标准)作为冠心病组，男42例，女26例;年龄41～83岁，平均年龄(61±8)岁。2组性别比、年龄间有均衡性。

1.2 试验材料 BALB/c小鼠，购自中国医学科学院基础医学研究所实验动物中心;SP2/0细胞株，由军事医学科学院动物所惠赠;弗氏佐剂，本实验室自制;ApoA5抗原，由北京博奥森生物技术有限公司合成;羊抗鼠-HRP购自博奥森生物技术有限公司;辣根过氧化物酶(HRP)，Sigma产品。ApoA1、ApoB抗原由卫生部北京老年医学研究所惠赠。TG、胆固醇(TC)、高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)、ApoA1、ApoB试1盒、全自动生化分析仪均为罗氏公司产品。

1.3 方法

1.3.1 动物免疫:用常规免疫法免疫BALB/c小鼠，第1次用完全佐剂，第2、3次用不完全佐剂，第4次由脾脏直接注射。

1.3.2 抗ApoA5单克隆抗体(McAb)的制备:①细胞融合:取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50%聚乙二醇(PEG)的作用下8∶1比例进行融合，10 d后检测抗体，选取阳性孔，采用有限稀释法克隆化，待克隆阳性率100%时，扩大培养，制备腹水。②抗体特异性测定:固相载体分别包被ApoA5、ApoA1、ApoB和人血清白蛋白，用ELISA法测定。抗体的Ig及亚类鉴定采用双相免疫扩散法。③抗体的效价测定:取上清和腹水，用0.9%氯化钠溶液稀释成不同浓度，用ELISA法测定其效价。

1.3.3 ApoA5 ELISA测定方法的建立:利用制备的 ApoA5 McAb，建立ELISA双抗体夹心法，并对实验条件进行优化。利用棋盘滴定的方法对包被抗体的浓度、血清稀释倍数、酶标抗体的稀释倍数进行了选择。

1.3.4 其他生化指标测定:TG、TC、HDL-C、LDL-C采用酶法测定;ApoA1、ApoB采用免疫比浊法用罗氏全自动生化分析仪进行测定。

1.4 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以¯x±s表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 抗人ApoA5单克隆抗体的制备及免疫学分析 按常规法免疫，取小鼠眼睛血，经检测效价为1∶64。取免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合，筛选出阳性的杂交瘤细胞株5个，分别命名为A51、A52、A53、A54和A55。经检测，阳性细胞株上清效价达到1∶256;腹水效价达到1.6×105;5株McAb与ApoA5特异性反应，与ApoA1、ApoB和人血清白蛋白均无交叉反应，说明各McAb是高度特异的;5株McAb均为IgG2a。

2.2 ELISA方法的建立 利用棋盘滴定的方法对包被抗体的浓度、血清稀释倍数、标准曲线和酶标抗体的稀释倍数进行了选择。结果表明当包被抗体浓度为1∶800，酶标抗体浓度为1∶400，血清稀释倍数为1∶200时曲线效果最佳。

2.3 标准工作曲线的建立 ApoA5-ELISA的标准曲线见图1。ApoA5浓度在10.0～320.0 μg/L范围内，曲线线性关系良好。本法测定的灵敏度为2.0 μg/L。

2.4 临床应用 冠心病组TC、TG、LDL-C和ApoB水平明显高于对照组(P<0.05)，而HDL-C、ApoA1和ApoA5水平明显低于对照组(P<0.05)，见表1。结果表明，ApoA5与HDL-C、ApoA1水平呈正相关(r值分别为0.53和0.63)，与TC、TG、 LDL-C、ApoB呈负相关(相关系数分别为 －0.69、－0.63和－0.69)。

图1 ApoA5测定标准曲线

3 讨论

研究表明，ApoA5基因多态性中少见等位基因与血清TG增加有关［3-7］。同时动物实验和临床研究证明ApoA5在体内TG代谢过程中发挥重要作用，敲除ApoA5基因小鼠的血浆TG水平约是正常对照的4倍，同时伴有极低密度脂蛋白(VLDL)的升高;相反，转入人ApoA5基因的小鼠，其血浆TG水平下降66%，VLDL亦有下降;这些表明ApoA5表达与TG呈高度负相关［1，2］。因此，制备高效、特异的抗ApoA5单抗对于心血管疾病的诊断和治疗具有良好的应用前景。

本研究利用ApoA5引物，扩增出ApoA5 cDNA的全长编码序列和C端序列，将其连接到pQE30载体上，获得了全长和片段His融合蛋白，纯化复性后得到高纯度的ApoA5蛋白。以它为抗原通过杂交瘤技术建立了杂交瘤细胞株，成功制备出了鼠源性的抗ApoA5的单抗。经特异性测定表明，单抗仅与纯化的ApoA5反应，与其他抗原无交叉反应，表明抗ApoA5的单抗具有较高的特异性。

在抗体的制备过程中，我们发现有很多因素影响了单抗的效价和特异性。首先，人ApoA5与小鼠ApoA5具有高度的同源性，可达到70%以上，这就增加了制备ApoA5鼠源单抗的难度。因为蛋白的同源性越高，在生物体内产生有效免疫的可能性越低，从而不产生抗体或产生的抗体很少。其次，抗原的浓度也很关键。如果抗原浓度太低，动物也不会产生相应的抗体。我们就需要加大抗原浓度或增加免疫次数。另外，通过基因工程合成的抗原，虽然有效解决了由于天然蛋白含量少而不利于研究的问题，但是合成的抗原毕竟是在原核生物中产生的，其结构很可能与体内蛋白的结构不完全一致，从而不能高度有效的检测人体内的ApoA5，达不到预期的理想效果。因此，关于抗ApoA5 McAb在临床上的应用，将另文报道。

表1 2组血脂检测结果比较±s

表1 2组血脂检测结果比较±s

注:与正常对照组比较，*P<0.05，#P<0.01

组别 TC(mmol/L) TG(mmol/L) HDL-C(mmol/L) LDL-C(mmol/L) ApoA1(g/L) ApoB(g/L) ApoA5(μg/L)正常对照组(n=145) 4.3±0.7 1.4±0.6 1.2±0.4 2.9±0.8 1.3±0.3 1.0±0.4 74±10冠心病组(n=68) 5.2±1.0* 1.8±0.8* 0.8±0.6* 3.8±0.9# 0.9±0.3# 1.8±0.8# 62±10*

在ApoA5 ELISA建立过程中，我们对实验条件进行优化，选择包被抗体浓度为1∶800，酶标抗体浓度为1∶400，血清稀释倍数为1∶200。标准曲线测量范围10.0～320.0 μg/L，测定的灵敏度为2.0 μg/L。该方法初步应用于临床，正常对照组和冠心病组血清ApoA5水平分别为(74±10)和(62±10)μg/L，冠心病患者的ApoA5水平明显低于正常对照组(P<0.05)。通过ApoA5与脂质相关性研究发现，ApoA5与HDL-C、ApoA1组呈正相关，与TC、TG、LDL-C、ApoB呈负相关。表明ApoA5参与脂质代谢，对于高脂血症有潜在的调节作用。

1 Vander Vliet HN，Sammels MG，Leegwater AJ，et al.Apolipoprotein A-V: a novel apolipoprotein associated with an early phase of liver regeneration.J Biol Chem，2001，276:44512-44520.

2 Pennacchio LA，Olivier M，Hubacek JA，et al.An apolipoprotein influencing triglycerides in humans and mice revealed by comparative sequencing.Science，2001，294:169-173.

3 Pennacchio LA，Olivier M，Hubacek JA，et al.Two independent Apolipoprotein A5 haplotypes influence human plasma triglyceride levels.Hum Mol Genet，2002，11:3031-3038.

4 Talmud PJ，Martin S，Taskinen MR，et al.APOAS gene variants，lipoprotein particle distribution，and progression of coronary heart disease:results from the LOCAT study.J Lipid Res，2004，45:750-756.

5 毕楠，鄢盛恺，李国平，等.冠心病患者载脂蛋白A5和载脂蛋白C3基因多态性的研究.中华心血管杂志，2005，33:116-121.

6 Austin MA，Talmud PJ，Farin FM，et al.Association of apolipoprotein A5 variants with LDL particle size and triglyceride in Japanese Americans. Biochim-Biophys-Acta，2004，1688:1-9.

7 Kao JT，Wen HC，Chien KL，et al.A novel genetic variant in the Apolipoprotein A5 gene is associated with hypertriglyceridemia.Hum Mol Genet，2003，12:2533-2539.

Preparation and characterization of monoclonal antibodies against human apolipoprotein A5 and its clinical application

JIAO Juan，ZHAO Mancang，WEI Wenqing，et al.Department of Central Laboratory，General Hospital of Beijing Military Command，Beijing100700，China

ObjectiveTo prepare the monoclonal antibodies against human apolipoprotein A5(ApoA5)，and to establish a double antibody sandwich enzyme-linked immunoassay for the clinical detection of human ApoA5.MethodsThe BALB/c mice were immunized with recombinant ApoA5 to prepare the McAb.The antibody titers，specificity，subclass and antigenic determinants of the McAb were identified and measured.The serum ApoA5 levels of 145 healthy people and 68 patients with CHD were detected by ELISA.ResultsFive hybridoma cell lines secreting McAb against human ApoA5 were obtained，they were highly specific to ApoA5 and all belonged to the subtypes of IgG2a.The ascites titer reached 1.6×105.The levels TC，TG，LDL-C and ApoB in CHD group were significantly higher than those in control group(P<0.05)，however the levels of HDL-C，ApoA1 and ApoA5 in CHD group were significantly lower than those of control group(P<0.05).ConclusionThe APOA5 levels are positively related to HDL-C，ApoA1 levels，however，which are negatively correlated with TC，TG，LDL-C，ApoB levels.To explore the exact relationship between ApoA5 levels and hyperlipidemia may have potential clinical significance in prevention and treatment of cardiovascular diseases.

apolipoprotein A5;monoclonal antibodies;serum lipid;coronary heart disease

R 589.21

A

1002－7386(2010)03－0264－03

100700 北京市，中国人民解放军北京军区总医院中心实验科

赵满仓，100700 中国人民解放军北京军区总医院; E-mail:zhaomc456@163.com

2009－08－12)