蛋白质质谱在声门上型喉鳞癌早期诊断中的研究

陈 涛，王荣旋，蒋科会

（遵义医院，贵州 遵义 563002）

声门上型喉癌早期症状不典型，仅有咽部异物感，感觉咽部食物吞咽不净，症状轻微，容易误诊。大部分病人来就时已属中晚期，预后较声门型喉癌差，需行部分喉切除或喉全切除术，严重影响患者的生存质量，因此声门上型喉癌早期诊断显得尤为重要。本研究拟应用表面加强激光解吸电离飞行时间质谱技术及其配套的蛋白质芯片对声门上型喉鳞癌患者和正常对照者血清中的蛋白质组图谱进行检测，结合相关软件建立决策分类树诊断模型，提高早期诊断率。

1 临床资料

1.1 临床资料与标本来源 选择2005年1月1日至2009年12月31日间，在遵义医院住院首次治疗的声门上型喉鳞癌患者30例，其中男24例，女6例，年龄为42～78岁，中位年龄62岁，临床病例资料完整，入院第二天晨起抽血，2小时内提取血清无溶血者，血清提取后即入-80℃保存。对照组选用同期本院职工体检健康者血清标本30例，作为正常对照组，年龄为40～83岁，中位年龄60岁。

1.2 实验方法 血清标本收集：清晨空腹采取全血标本，常温下放置2h，待自然凝固后，4℃1000 r/min离心30 min，取上层血清EP管分装后立刻置血清标本库-70℃冰箱保存备用。

血清样品预处理：取出-70℃保存血清，0℃冰浴中溶解，4℃10000 r/min离心2min，取5μl血清样品，加入 8mmol/L 尿素 10μl，4℃振荡 30min，吸取上清用于蛋白质芯片检测。

SELDI操作流程：在CM10蛋白质芯片8个点（A-H点）的表面分别加10mM HCl 10uL，在湿盒内放置10min后，吸去剩余的HCl，用去离子水洗芯片3次。将芯片安装于生物处理器上。芯片A～H各点用200ul结合缓冲液（100mM NaAc乙酸钠，pH4.0）预处理2次，每次室温下振荡孵育5分钟。然后每点交叉滴加100ul已处理的声门上型喉鳞癌或正常对照血清样品，室温振荡孵育60min。弃掉表面样品，各点用200 ul结合缓冲液洗涤3次，每次5min。最后各点再用1mM HEPES（pH 7.0）200ul迅速洗涤一次。卸去生物处理器，待芯片表面自然晾干后，各点加两次0.5ul SPA，待芯片表面干燥后，用蛋白质芯片阅读机进行蛋白质谱分析。

数据采集：采用PBSII-C型蛋白质芯片阅读机读取CM10芯片数据。每天使用前用Ciphergen公司提供的标准多肽和低于200kD的蛋白质标准分子标化校正质谱仪，系统质量偏差为0.1%。检测芯片时蛋白质芯片阅读机设置条件如下：激光能量200，检测敏感度9，优化分子量范围1~70kD，每个样品收集50个点，采用Ciphergen proteinchip分析软件自动采集数据。

1.3 统计学方法 因绝大多数检测出的蛋白质质荷比 (mass-to-charge ratios,m/z)在1000～70,000范围内，故取该范围为研究区间。利用Biomarker Wizard软件对蛋白质峰进行归类分析，设定信噪比为5，不同组间相同质荷比的蛋白质峰值比较采用方差分析，统计分析由该软件自动进行。两个蛋白质峰比较时，差异蛋白定义为蛋白质峰值强度相差1倍以上。利用Biomarker Patterns Software对数据进行树状分组统计及相关性进行分析，建立分类树模型。

2 结果

2.1 声门上型喉鳞癌组和正常对照组血清蛋白指纹图谱 绝大多数的蛋白质峰数量和强度在声门上型喉鳞癌患者和正常对照者血清中基本相同，P≤0.05时，两组间有9个差异性表达蛋白峰，其中3个在声门上型喉鳞癌患者血清中高表达，m/z分别是9194.06，11681.15 和 51370.19，6 个低表达，m/z分别是 8815.96，13767.56，13884.95，14057.50，15879.20和17377.60。P≤0.01时有4个显著差异性表达蛋白峰，其中3个在声门上型喉鳞癌患者血清中高表达，m/z分别是 9194.06，11681.15 和 51370.19，1 个低表达，m/z是8815.96。两组血清差异蛋白峰的峰值强度具体数值比较按P值排列见表1。

表1 声门上型喉鳞癌组和正常对照组血清中差异蛋白峰的表达强度比较Table 1 Signal intensities of the differentially expressed proteins peaks in serum of supraglottic laryngeal squamous cell cancer and control group

根据软件分析按照p值统计的结果m/z为11681的蛋白质峰为候选差异峰，在声门上型喉鳞癌中有高表达的趋势，图1和图2为在11400~12000区段部分SELDI图谱对比，图3为11400~12000区段部分模拟电泳图对比。

图1 声门上型喉鳞癌患者和健康对照血清11400~12000区段蛋白质指纹图谱比较Fig1 The spectral view of differently expressed protein peaks at the m/z value from 11400 to 12000 between supraglottic laryngeal squamous cell cancer patients and control group

图2 声门上型喉鳞癌患者和健康对照者血清11400~12000区段SELDI图谱比较图Fig 2 Differently expressed protein peaks at the M/Z value of 11681 between supraglottic laryngeal cancer patients and control group

2.2 声门上型喉鳞癌决策分类树诊断模型的建立将Biomarker Wizard软件分析获得有差别的蛋白质峰建立数据库，导入Biomarker Pattern统计分析软件采用决策聚类树分析法进行分析处理（灵敏度界定于0.05）。结果显示没有一个标志蛋白能单独将声门上型喉鳞癌患者和正常人完全分开。分析系统经过筛选，m/z值分别为9194.06，15879.1，51370.1，6624.57，8929.80，1013.77 和 11681.1 的 蛋 白 峰 被Biomarker Pattern软件自动选取用于建立树状决策分类模型，包括8个结点 (Node)和9个终结点(Terminal Node)。

图3 声门上型喉鳞癌患者和正常对照血清11400~12000区段SELDI蛋白质强度的模拟电泳比较图Fig 3 Com parison of SELDI gel-view profiles at the m/z value from 11400 to 12000 between supraglottic laryngeal squamous cell cancer patients and control group

应用软件计算声门上型喉鳞癌和正常对照组各差异蛋白峰的权重，结果7个显著差异性蛋白质峰按变量重要性评分依次为：M9194_06(100)，M51370_1(98.6),M15879_1(69.06),M6624_57(66.91)，M8929_80(57.75),M11681_1(53.55),M1013_77(44.17)。

采用该分类树建立起来的声门上型喉鳞癌诊断模型，在学习模式下(learning)，在30例声门上型喉鳞癌患者中有26例被树状分析模式正确筛出，灵敏度(sensitivity)为86.66%，30例正常人有27例完全被正确筛出，特异度(specificity)为90%。

3 讨论

声门上型喉鳞癌是恶性程度较高的一种肿瘤，早期症状隐匿，不易引起患者甚至非专科医生的注意，确诊时多已晚期。尽管近年来无论是外科技术还是放疗、化疗、生物靶向治疗等综合治疗措施均取得较大进展，但声门上型喉鳞癌的治疗效果仍不理想，生存率较低，严重威胁患者的生存和生活质量[1~2]。因此有必要寻求一种有效的早期诊断方法，使疾病在发生的早期就可以发现，并得到控制和治疗，进而提高治愈率，改善患者的预后。

差异蛋白质组学技术可以比较肿瘤和正常细胞之间的蛋白质组异同，从而发现肿瘤特异性蛋白找到肿瘤标志物。蛋白质组技术的规模化特点使得同时找出与肿瘤相关的多个蛋白或蛋白群成为可能，从而提高对疾病的认识。近年来，各种蛋白质组研究技术在肿瘤的发病机制、早期诊断、分型、疗效评价等方面获得应用，发现了一系列肿瘤相关蛋白和潜在的肿瘤蛋白标志物，为肿瘤研究提供了丰富资源。SELDI技术是近几年才发展起来的一种新的临床蛋白组学方法，具有操作简便、可直接分析原始生物样本（如血清、尿液、胸腹水等）、样本用量小等特点，同时适合多样品平行检测和直接进行蛋白质全景式的搜索和分析，特别是对小分子量蛋白和低丰度蛋白具有较高的捕获效果，可以与其他蛋白质组学方法互补，有望成为一种前景广阔的恶性肿瘤诊断新方法，该技术较高的特异性和敏感性在卵巢癌、前列腺癌、肝癌和肺癌等已有多篇报道[3~6]。

卵巢肿瘤在临床上缺乏敏感特异的肿瘤标志物，美国FDA和NIH的临床蛋白质组研究小组的成员Petricoin等[7]用疏水性蛋白芯片对50例健康妇女、50例卵巢癌患者的血清蛋白进行了分析，结果发现与健康人相比，在质荷比值为534、989、2111、2251和2465处的5峰同时发生变化，其中卵巢癌患者血清中2251波峰下降，其余均升高，对于诊断具有重要意义。应用该模型对116例来自健康、早期和晚期卵巢癌以及良性疾病妇女的血清样品进行盲法分析预测。结果50例卵巢癌的样品被全部准确检出，其中包括18例早期患者。66例非恶性肿瘤人群对照组中有63例确定为非恶性肿瘤。此结果表明，该方法的灵敏度为100%(95%CI93～100)，特异度为95%(87%～99%)，阳性预测值为 94%(84%～99%)。结果说明，运用SELDI-TOF-MS技术可以筛选出高效的蛋白标记，并可在临床上用于卵巢癌的早期诊断。

Yang等[8]用SELDI-TOF-MS对158例肺癌患者和50例正常对照者的血清进行了分析。发现有18个蛋白质峰异常表达。选取其中相对分子质量为11493、6429、8245、5335 和 2538 的 5 个蛋白质峰建立一个肿瘤标志物图谱，经盲法检测后，发现其诊断肺癌的敏感度和特异度分别为86.9%和80%(非小细胞肺癌的敏感度达91.4%)，其阳性预测值为92.4%。其中，对于早期肺癌的敏感度为79.1%，远远超过了目前临床使用的肿瘤标志物。

Zhukov等[9]联合激光捕获显微切割和蛋白质芯片SELDI-TOF-MS技术，对正常喉组织、非典型腺瘤样增生和恶性肿瘤的冰冻切片进行激光捕获显微切割，获得纯的细胞数进行质谱分析时发现，SELDI质谱在探测喉肿瘤相关蛋白质图谱上具有高度重复性。(17~23)×103范围内的3个峰值在肿瘤细胞系中比正常细胞明显增加，其中峰值17.25×103蛋白在任何一个正常的细胞样本中均未被发现，而在非典型腺瘤样增生组中呈低水平表达。

由于血清能反复获得，且血液中包含众多尚未知的生物标志物，因此本研究利用血清进行其蛋白质的分析。细胞内数以万计的不同蛋白质及其裂解或修饰形式是细胞生理或病理活动的反映，这些蛋白质和蛋白质片段随着周围的血液和淋巴液进入循环，因而在血清蛋白质中，除高丰度或大分子的驻留蛋白如白蛋白、球蛋白和其它载体蛋白外，还有低丰度的小分子蛋白质或蛋白质片段，而后者包含着大量的诊断信息[10]。

本研究应用蛋白质芯片SELDI-TOF-MS技术检测了50例声门上型喉鳞癌和50名正对照血清标本。发现两组间有9个差异性表达蛋白峰，其中3个在声门上型喉鳞癌患者血清中高表达，m/z分别是9194.06，11681.15和51370.19，6个在声门上型喉鳞癌患者血清中低表达，m/z分别是8815.96,13767.56,13884.95,14057.50,15879.20和17377.60。应用数据建立分类树模型，获得了一个由7个蛋白9194.06,51370.1,15879.1,6624.57,8929.80,11681.1,1013.77组成的标志蛋白组合模式。在训练组中，该模式的敏感性和特异性分别为86.66%和90%，是一种高敏感性、高特异性的声门上型喉鳞癌诊断方法，有望成为临床上从高危人群中快速方便筛查声门上型喉鳞癌患者的诊断平台。

[1]Chijiwa H,Mihashi H,Sakamoto K,et al.Supraglottic carcinoma treatment results analysed by therapeutic approach[J].JLaryngol Otol Suppl,2009,5(31):104-107.

[2]Papadas TA,Alexopoulos EC,Mallis A,et al.Survival after laryngectomy:a review of 133 patientswith laryngeal carcinoma[J].Eur Arch Otorhinolaryngol,2010,267(7):1095-1101.

[3]Petrcoin EF,Liotta LA.SELDI-TOF based serum proteomic pattern diagnostics for early detection of cancer[J].Curr Opin Biotechnol,2004,15(1):24-30.

[4]Adam BL,Qu Y,Davis JW,et al.Serum protein fingerprinting coupled with a pattern-matching algorithm distinguishes prostate cancer from benign prostate hyperplasia and healthy men[J],Cancer Res,2002,3(62):3609–3614.

[5]S.G.Soltys,G.Shi,R.Tibshirani,et al.The Use of Plasma SELDI-TOF MS Proteomic Patterns for Detection of Head and Neck Squamous Cell Cancers(HNSCC)[J].International Journal of Radiation Oncology Biology Physics,2003,57(2):202-212.

[6]E.F.Petricoin,D.K.Ornstein,C.P.Paweletz,A.Ardekani,P.S.Hackett,B.A.Hitt,et al.,Serum proteomic patterns for detection of prostate cancer[J].JNatl Cancer Inst,2002,52(94):1576-1578.

[7]Petricoin EF,Ardekani AM,Hitt BA,et al.Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer[J].Lancet,2002,359(9306):572-577.

[8]Yang SY,Xiao XY,Zhang WG,et al.Application of serum SELDIproteomic patterns in diagnosis of lung cancer[J].BMC Cancer,2005,20(5):83-89.

[9]Zhukov TA,Johanson RA,Cantor AB,et al.Discovery of distinct protein in profilesspecific for laryngeal tumors and malignant laryngeal lesions by SELDI mass spectrometry[J].Laryngeal Cancer,2003,40(3):267-279.

[10]J.Li,Z.Zhang,J.Rosenzweig,et al.Proteomicsand bioinformatics approaches for identification of serum biomarkers to detect breast cancer[J].Clin Chem,2002,13(48):1296-1304.