兔附红细胞体的体外培养

李晓云 (湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙 410128；华中农业大学动物医学院，湖北 武汉 430070)

贾杏林 (湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙 410128)

石德时，毕丁仁 (华中农业大学动物医学院，湖北 武汉 430070)

兔附红细胞体的体外培养

李晓云
(湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙 410128；华中农业大学动物医学院，湖北 武汉 430070)

贾杏林
(湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙 410128)

石德时，毕丁仁
(华中农业大学动物医学院，湖北 武汉 430070)

为探讨无细胞条件下体外连续培养兔附红细胞体的方法，将感染附红细胞体的兔红细胞接种到多种培养基内培养，不添加阴性红细胞，每次传代更换半量培养基，结果发现经配方筛选的霉形体培养基培养兔附红细胞体效果最佳，兔附红细胞体存活可达300 d，并保持感染兔阴性红细胞的能力。兔附红细胞体可以在经配方筛选的霉形体培养基中长期存活并缓慢增殖。

嗜血性霉形体(附红细胞体)；兔；PPLO肉汤；体外培养

近年来的研究表明，寄生在哺乳动物红细胞表面的、缺少细胞壁的多形态微生物，分类学上应属于霉形体(Mycoplasma,M)，为区别于原有的霉形体，又称为嗜血性霉形体(Haemomycoplasma,HM)[1～4]。由于附红细胞体的体外培养技术缺乏，致使其研究主要局限于分类学、分子诊断等方面。Nonaka[5]、张守发[6]、房春林[7]等通过添加阴性红细胞的方法尝试了猪、牛、兔等动物的附红细胞体的体外培养，近年李晓云等[8,9]先后进行了猪附红细胞体(M.suis)和犬附红细胞体的体外无细胞培养试验，但体外无细胞培养兔附红细胞体的试验，国内外尚未见报道。

1 材料与方法

1.1 培养基与主要试剂

主要试剂有PPLO Broth(Difco)、灭活新生牛血清(BS，杭州四季青生物技术有限公司)、马血清(equine serum,ES,Hyclone)、猪血清(porcine serum,PS,Gibco )、M199、DMEM、RPMI1640、DMEM/F12(Gibco)、NAD(Amresco)、强力霉素(中国兽医药品监察所)等，其它试剂均为AR级。

培养基参考文献[8～10]的方法配制，PPLO基础液、添加成份(Supplement，S)、3种PPLO完全培养液(PPLO-S-BS,PPLO-S-ES，PPLO-S-PS)，M199-BS、DMEM-BS、RPMI1640-BS、DMEM/F12-BS按说明书配制后添加20%(v/v)BS。所有培养液4 ℃保存备用，使用前用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl调节pH至7.4。

1.2 病原及红细胞

静脉采集消瘦、贫血的新西兰大白兔全血，柠檬酸三钠抗凝，对采集的红细胞进行悬液镜检、Giemsa染色镜检，观察其形态染色特点，筛选感染附红细胞体的血样。兔附红细胞体阴性红细胞，同法采集自健康无附红细胞体病史兔，经染色镜检未观察到染虫现象。上述血样部分4 ℃短期保存，其余液氮罐中长期保存备用。

1.3 病原接种与培养

感染附红细胞体的兔红细胞，参考文献[8,9]的方法分别接种到PPLO-S-BS、PPLO-S-PS、PPLO-S-ES、PPLO-S、M199-BS、DMEM-BS、RPMI1640-BS、DMEM/F12-BS中培养，不添加阴性红细胞，每次传代更换半量培养基。倒置显微镜下(400×)观察虫体的生长存活状态及红细胞形态变化、溶血情况。选择虫体生长状况最好的培养基进行连续培养。

1.4 培养物的鉴定

培养期间定期收集培养物，采用文献[8,9]的方法鉴定。

2 结果与分析

2.1 兔附红细胞体分离鉴定

直接镜检可见染虫红细胞有不同程度的变形，染虫数量不同的红细胞形态不同，有“棘球”状、环形“串珠”状、近圆形等(图版Ⅳ图1)，虫体呈饱满光亮的球状颗粒，红细胞具有自主运动，包括上下前后左右摆动、短距离滑行、滚转。Giemsa染色结果显示，虫体着浅蓝色，呈中央清亮的环状(图版Ⅳ图2)，与布坎南描述的附红细胞体染色特点一致[11]。

2.2 不同培养基培养效果的比较及培养基筛选

染虫兔红细胞接种后，红细胞于12～72 h间溶血，成为带虫血影，不同培养基培养结果的比较见表1。由表1可知，PPLO-S-BS培养基中虫体颗粒饱满，单个血影上虫体数量较多，血影形态较完整，故选择PPLO-S-BS作为兔附红细胞体连续培养的培养液。

表1 不同培养基培养兔附红细胞体结果Table 1 The results of in vitro cultivation of Haemomycoplasma of Rabbit in various culture media

2.3 连续培养

带兔附红细胞体血影可连续培养300 d以上，其形态特点基本不变，保持自主运动性。培养过程中，未添加任何红细胞，血影染虫率维持近100%，游离虫体较少。

2.4 培养物鉴定

(1)光镜特点 血影直接压片镜检结果见图版Ⅳ图3。镜下可见透明的血影附着5～6个以上大小不等的颗粒状虫体，主要分布在血影周缘，血影有摆动、短距离滑行、滚转等形式的自主运动。Giemsa染色后血影上虫体深蓝色。

(2)培养物感染阴性红细胞试验结果 PPLO-S-BS中带虫血影与阴性红细胞共同培养6 h后，少量红细胞上开始观察到染虫现象，致12 h后染虫率达到25%左右。

(3)培养物对抗生素的敏感性 强力霉素作用后，镜下观察到大量的细小的形态不规则的虫体出现在培养液中，作升降、扭转、翻滚、伸屈、摇摆、转圈等运动。作用30 min后血影以及游离出来的虫体均静止不动，血影上虫体数量明显减少。相同浓度青霉素、链霉素作用后，未观察到血影形态及运动特点的变化。

结果表明兔附红细胞体感染血影所带寄生体具有感染阴性红细胞的能力，保持自主运动活性，对强力霉素敏感，对青霉素、链霉素不敏感。

上述研究结果表明,兔附红细胞体可以在经配方筛选的霉形体培养基中长期存活并缓慢增殖。

3 讨论

本研究筛选的霉形体培养基能够在无细胞条件下体外长期维持兔附红细胞体的存活，对于解决兔附红细胞体体外培养技术具有重要意义。上述结果与培养M.suis[8]、犬附红细胞体[9]的结果相近，进一步从培养特性的角度一定程度上支持了附红细胞体属于霉形体的观点。

本研究除首次接种的染虫红细胞外，未添加任何红细胞或红细胞制品，虫体在培养过程中始终与血影处于黏附状态，这一特点与M.suis[8]、犬附红细胞体[9]相同，可见兔附红细胞体的存活也并不依赖活的红细胞。

比较不同排培养基培养结果，霉形体培养基优于人工配方培养基，血清是必须添加的成份之一，BS优于PS和ES。而在人工培养基中，DMEM/F12中存活情况最差，DMEM/F12与M199、DMEM、RPMI1640的配方差异主要在微量元素(Cu2+、Fe3+、Zn2+)[12]。上述结果显示，血清中某些成份、存在于霉形体培养基中而人工培养基中缺乏的某些天然成份，包括某些微量元素可能与附红体存活有密切关系，对上述问题的进一步研究将有助于解决目前附红细胞体在体外培养条件下尚不能大量增殖的难题。

[1]Neimark H, Johansson K E, Rikihisa,Yetal.Revision of haemotrophicMycoplasmaspecies names[J].Int J Syst Evol Microbiol,2002,52:683.

[2]Messick J B.Hemotrophicmycoplasmas(hemoplasmas):a review and new insights into pathogenic potential[J].Vet Clin Pathol,2004,33:2～13.

[3]Tasker S, Helps C R, Day M J,etal.Phylogenetic analysis of hemoplasma species:an international study[J].J Clin Microbiol,2003,41:3877～3880.

[4]付 媛，李树清，杜 凯，等．温氏附红细胞体16S rRNA 基因的序列测定和分析[J]．畜牧兽医学报,2006,37 (5),518～522.

[5]Nonaka N, Thacker B J, Schillhorn van Veen T W,etal.Invitromaintenance of Eperythrozoon suis[J].Vet Parasitol,1996,61:181～199.

[6]张守发,张国宏,宋建臣，等．牛附红细胞体体外培养试验[J]．中国兽医科技,2002，32(8)：27～29.

[7]房春林，杨光友．猪兔附红细胞体的体外培养研究[J]．中国兽医科技，2005，35(3)：190～193.

[8]李晓云，贾杏林，石德时，等．猪附红细胞体体外连续培养[J]．畜牧兽医学报,2008,39(8):1142～1146.

[9]李晓云，石德时，李自力，等．犬附红细胞体的体外连续培养[J]．中国兽医学报，2009,29(9):1125～1128.

[10]毕丁仁，王桂枝．动物霉形体及研究方法[M]．北京：中国农业出版社，1998.126.

[11]布坎南R E,吉本斯N E．伯杰细菌鉴定手册[M]．北京：科学技术出版社，1984.1268～1270.

[12]章静波，徐存拴．动物细胞培养(第4版)[M]．北京：科学出版社，2004.107～111.

2010-07-08

湖南省科技厅资助项目(2009FJ3021)；湖南省教育厅资助项目(10C0809)

李晓云(1968-)，女，湖北天门人，农学博士，讲师，主要从事兽医微生物与免疫方向研究.

毕丁仁，E-mail: bidingren@mail.hzau.edu.cn.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.03.018

S852.62;Q813.1

A

1673-1409(2010)03-S051-03