籼稻胚乳特异性启动子Gt1的克隆及其功能验证

刘 峰

赵伊英

(石河子大学农学院，新疆 石河子 832003)

郑金贵

(农业部海峡两岸农业技术合作中心，福建农林大学生命科学学院，福建 福州 350002)

籼稻胚乳特异性启动子Gt1的克隆及其功能验证

赵伊英

(石河子大学农学院，新疆 石河子 832003)

郑金贵

(农业部海峡两岸农业技术合作中心，福建农林大学生命科学学院，福建 福州 350002)

从籼稻(OryzasativaL.ssp.indica)品种谷秆两用稻‘东南201’中克隆获得胚乳特异性启动子Gt1；序列全长为929 bp；含胚乳中特异表达所必需的正调控元件GCN4 motif(TGAGTCA)与Skn-1 motif(GTCAT)等。与已报道的粳稻品种‘日本晴’的序列相比，籼稻‘东南201’Gt1启动子序列仅在-507 bp处发生一个碱基突变，在-268、-267、-194、-193 bp位置处分别缺失1个碱基；但在已知功能motif，两者没有任何差异。用Gt1替代35SCaMV启动子驱动GUS基因转化水稻‘台粳9号’，结果表明GUS基因仅在胚乳中特异表达，而在其它组织中未表达。克隆的籼稻谷蛋白基因Gt1的启动子序列，可为进一步开展水稻品质分子改良提供必要手段。

胚乳特异性启动子；籼稻(OryzasativaL.ssp.indica)；转基因

启动子是基因表达所必需的，其决定了外源基因在转基因植物中表达的空间、时间和表达的强度等，是人们定向改造生物的重要限制因素[1]。目前在植物表达载体中广泛应用的启动子是组成型启动子。然而，由于组成型启动子驱动外源基因在受体植物内所有部位持续的表达，不仅造成浪费，而且往往会影响植株正常的生长发育[2]。组织特异型启动子可将外源基因集中在某一时间和/或目标组织中表达，不仅可避免因在转基因植株非目标组织中表达所造成的能量浪费，而且也可避免因在非收获器官或组织中表达目标蛋白而造成的转基因食品的潜在不安全性等[3～7]。因此，组织特异性启动子不仅有助于阐明植物形态、发育、代谢途径等基础理论，而且具有广泛的应用价值。胚乳特异型启动子是组织特异型启动子的一种，它可以控制外源基因在植物胚乳中高效表达，避免外源基因在植物的其他部位表达，从而减少对植物的不利影响。水稻种子(胚乳)中的蛋白主要由醇溶蛋白和谷蛋白组成；其中谷蛋白占种子贮存蛋白的70%～80%[8]。因此，以水稻为材料，从水稻谷蛋白基因Gt1的上游序列克隆出胚乳特异性启动子，对利用胚乳特异性启动子控制外源基因在水稻胚乳中特异表达具有重要理论和实践意义。

1 材料与方法

1.1 材料

籼稻(OryzasativaL.ssp.indica)品种‘东南201’为克隆启动子的实验材料，是农业部海峡两岸农业技术合作中心选育的优质特种谷秆两用稻。粳稻(OryzasativaL.ssp.japonica)品种‘台粳9号’为水稻转化材料。

1.2 菌种、质粒与主要试剂

大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α、根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105；质粒载体pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121由笔者所在实验室保存提供；克隆载体pMD18-T、ExTaq酶、各种限制性内切酶、T4DNA连接酶等购自大连宝生物(TaKaRa)工程有限公司。

1.3 籼稻‘东南201’基因组DNA的提取及PCR法获得目标片段

采用百泰克生物工程公司植物基因组DNA提取试剂盒，提取‘东南201’的基因组DNA；以Takaiwa等[9]报道的粳稻品种‘日本晴’的Gt1序列为基础设计出一对特异性引物(划线部位为增加的HindIII与BamH Ⅰ酶切位点)：

G-P1:5’-GCGAAGCTTAGGTCATAGGGAGAGGGAGCT-3’

HindⅢ

G-P2:5’-GGCGGATCCGTTGTTGTAGGACTAATGAACTGAATG-3’

BamHⅠ

以获得的基因组DNA为模板进行PCR反应；扩增条件为94 ℃ 5 min，35个循环(94 ℃ 1 min，56 ℃ 5 min，72 ℃ 1 min)，72 ℃ 10 min。PCR产物胶回收操作步骤参照百泰克生物公司多功能DNA纯化回收试剂盒的说明进行。参照TaKaRa公司pMD18-T Vector试剂盒的说明将目的片段连接到pMD18-T Vector上，并转化大肠杆菌DH5α，筛选抗Amp菌落，同时进行菌落PCR鉴定和测序；并命名为pMD-Gt1。

1.4 载体构建和水稻遗传转化

利用DNA重组实验技术[10]构建质粒载体。用HindⅢ与BamHⅠ双酶切质粒载体pMD-Gt1，回收小片段(Gt1序列)；同样，用HindⅢ、BamHⅠ双酶切质粒载体pBI121，回收大片段。再将回收的小片段和大片段进行定向连接获得含Gt1序列与GUS基因的表达载体pBI121-Gt1。再用HindⅢ、EcoRⅠ双酶切质粒载体pBI121-Gt1，回收小片段；与此同时，HindⅢ、EcoRⅠ双酶切质粒载体pCAMBIA1300，回收大片段。再将此次回收的小片段和大片段进行定向连接获得含Gt1序列与GUS基因的水稻表达载体p1300-Gt1-GUS。采用冻融法将质粒p1300-Gt1-GUS导入根癌农杆菌EHA105中。与此同时，表达载体pCAMBIA1301也直接被导入另外的根癌农杆菌EHA105中，用来作为对比研究。限制性内切酶酶切及连接反应的反应体系、反应时间等均参照TaKaRa公司产品使用说明进行。

水稻遗传转化基本培养基为NB培养基[11]；取授粉后10～15 d左右的未成熟‘台粳9号’种子去壳后，于超净工作台，经70%的乙醇表面消毒1 min后，再用2% NaClO消毒28 min，无菌水漂洗4～5次，用解剖针挑出幼胚并接种于诱导培养基，Parafilm封严，26 ℃，暗培养。每16～18 d继代1次，继代3～6次的胚性愈伤组织用于农杆菌转化。愈伤组织转化、筛选、抗性愈伤分化及生根参照本课题组前期的研究[12]。

1.5 转基因水稻的PCR检测

使用百泰克生物工程公司植物基因组DNA提取试剂盒，提取转化的‘台粳9号’植株的基因组DNA；设计特异性引物对：GUS-F:5’-GCAACTGGACAAGGCACT-3’；GUS-R:5’-GCGTCGCAGAACATTACA-3’，其扩增GUS基因部分序列(680 bp)；进行PCR 检测。

1.6 GUS检测方法

采用组织化学染色法检测GUS在水稻组织细胞中的表达。取转化水稻植株不同部位的材料至小离心管中，加入适量GUS染色液(50 mmol/L PBS,pH 7.0；0.5 mol/L X-Gluc；50 mmol/L potassium ferricyanide；50 mmol/L potassium ferrocyanide；10 mmol/L EDTA、0.001% Triton X-100以及20%甲醇)。于37 ℃保温1 h至过夜；然后转入70%乙醇中脱色后观察。

1～3：水稻植株的PCR特异性扩增；4：DL 2000 Marker图1 PCR扩增全长籼稻‘东南201’胚乳特异性启动子序列Figure 1 Specific PCR amplification for Gt1 promoter sequence of “DN201”,an indica variety

2 结果与分析

2.1 胚乳特异性启动子的克隆与序列分析

应用植物基因组提取试剂盒提取籼稻品种‘东南201’叶片基因组DNA，PCR扩增产物电泳显示约在1 000 bp左右出现特异性条带(图1)。采用T-A克隆方法将PCR产物与pMD18-T连接、转化，获得重组质粒，命名为pMD-Gt；阳性克隆测序表明，片段全长为929 bp(图2)，其中包括35个核苷酸的5’UTR序列。对序列 motifs分析表明，克隆到的籼稻Gt1启动子核苷酸序列中含有在胚乳中特异表达所必需的正调控元件GCN4 motif(TGAGTCA)，Skn-1 motif(GTCAT)，序列上游-31 bp处包含一个TATA box(TATAAA)、-231 bp处包含一个核糖体结合位点(RBS：AGGAGG)；此外该序列还包含2个TAAATG motif(TAAATG)、1个CAC motif(CACCC)。该序列中不含有CAAT box(CCAAT)，这也与Takaiwa等[9]报道的粳稻品种‘日本晴(Nipponbare)’的研究一致。

与Takaiwa等[9]在粳稻品种‘日本晴’的研究的序列相比，两者的一致性达99%；克隆的籼稻品种‘东南201’启动子的片段仅在-507 bp处发生一个碱基突变；在-268 bp、-267 bp、-194 bp、-193 bp位置处分别缺失1个碱基。但在已知功能区(motifs)籼稻‘东南201’与粳稻‘日本晴’没有差异。从籼稻品种‘东南201’中克隆获得的胚乳特异性启动子Gt1的全长序列已在GenBank 登录，登录号为EU441217。

Skn-1 motif:胚乳中特异表达所必需的正调控元件:GCN4 motif:胚乳特异性表达的顺式调控元件；下划线或粗体标出的分别为TATA 盒(TATAAA)，RBS(AGGAGG)，基序TAAATG(TAAATG)与CAC(CACCC)等；克隆获得的胚乳特异性启动子Gt1的全长序列已在GenBank 登录，登录号为EU441217。图 2 克隆的籼稻‘东南201’(DN201)Gt1与粳稻‘日本晴’(RBQ)的Gt1序列比较Figure 2 Sequence comparison of Gt1 promoter from indica-type rice “DN201” and Gt1 promoter from japonica-type “Nipponbare”

2.2 转化植株的分子检测

使用分别含有p1300-Gt1-GUS及pCAMBIA1301表达载体(图3)的农杆菌EHA105分别转化水稻胚性愈伤，都获得转化植株。对转化植株GUS基因进行PCR扩增，结果表明，从转化植株扩增获得预期的680 bp的目的基因片段，而未转化的原品种未扩增出任何片段(图4)。

35Spro:35S启动因子;HPT:潮霉素选择标记基因;TpolyA:tpolyA终止子:RB:左边界;LB:左边界;Gt1:从灿稻品种“东南201”中克隆获得的胚乳特异性启动子图3 水稻高效表达载体pCAMBIA1301与p1300-Gt1-GUS的T-DNA区Figure3 SchematicrepresentationofpCAMBIA1301andp1300-Gt1-GUSexpressioncassettesusedforricetransformation1:DL2000Marker;2～3:pCABIA1301转化获得的植株;4～6:P1300-Gt1-GuS转化获得的植株;7:非转化对照植株;8:质粒p1300-Gt1-GuS图4 水稻植株叶片PCR检测GUS基因Figure4 DetectionofGUSgeneincontrol-andtransgenicriceleavesbyPCR

2.3 转GUS基因的水稻植株的GUS检测

为了确证所克隆的启动子的功能，取转基因植株不同部位的组织进行GUS检测。对水稻植株的根、茎、叶片、种子等组织的GUS检测结果表明，转p1300-Gt1-GUS表达载体的植株的GUS基因只在胚乳中特异性表达(图5)，其它组织染色均为阴性；而转pCAMBIA1301表达载体的植株在35SCaMV启动子作用下，GUS染色均为阳性。由此可以确认，Gt1为胚乳特异性表达启动子。

1:非转基因原水稻品种；2:转pCAMBIA1301水稻植株；3:转p1300-Gt1-GUS水稻植株图5 胚乳特异性启动子驱动GUS基因在‘台粳9号’胚乳中特异性表达Figure 5 The endosperm-specific expression of GUS gene driven by Gt1 promoter in rice ‘Taijing No.9’

3 讨论

近年来，利用胚乳特异性启动子驱动外源基因表达，进而改良水稻品质的研究越来越得到人们的重视。转基因育种研究中，利用具有特异性表达特性的启动子被认为是实现对目标基因高表达的重要途径，也是培育高效、安全转基因作物的首选[4]。Gt1启动子能有效启动目标基因在水稻胚乳中表达，以其作为启动子已先后获得了能降低血清胆固醇作用的“大豆米”(Soy-rice)[13]、可预防贫血的“铁蛋白米”(Ferritin rice)[14]和“高铁米”(Iron-rich rice)[15]等。

本研究克隆获得的籼稻‘东南201’谷蛋白基因的5’端启动子序列，与Takaiwa等[9]报道的序列共有5个碱基的差异。Takaiwa等[9]获得的序列是对日本粳稻品种‘日本晴(Nipponbare)’基因组DNA分析的结果，而本研究用的是籼稻品种‘东南201’。不同类型或品种间在同一个基因的启动子序列有可能存在一定的差异。然而对序列motifs分析表明，就重要功能区域来说，籼稻‘东南201’与粳稻‘日本晴’没有差异，两者具有相同的在胚乳中特异表达所必需的正调控元件、motifs等；这也说明生物体在进化过程中功能区域的高度保守性，不会因为环境等因素的变化而改变其遗传性。

转化植株经PCR鉴定GUS基因存在的情况下，用X-Gluc检测液对GUS基因表达的情况进行鉴定，从而验证了该启动子的功能。转基因表达要求具有经济有效的高水平的重组蛋白表达体系；植物种类繁多，遗传多样性丰富，植物基因的启动子和调控序列类型也多种多样，利用能在宿主体内高效表达的特异性启动子是提高外源基因在植物体内表达的一个有效途径。本研究克隆了籼稻谷蛋白基因Gt1的启动子序列，并证明其能引导GUS基因在胚乳进行组织特异性表达；这为我们进一步开展水稻品质分子改良提供重要手段。

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2009-05-27

国家自然科学基金(30671276)；国家转基因重大专项(2009ZX08001-032B)；福建省自然科学基金项目(2009J01058)

刘 峰(1976-)，男，河南固始人，理学博士，副研究员，主要从事品质生物技术研究.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.02.015

S188

A

1673-1409(2010)02-S044-05