局部亚低温对胆红素脑病仔兔脑基底节中多巴胺及5-羟色胺的影响

王丽梅,郝艳秋,石丽宏

胆红素脑病是游离胆红素通过血脑屏障进入脑组织,导致神经细胞中毒变性,出现神经系统异常表现[1]。胆红素脑病时,一些单胺类神经递质如多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)代谢紊乱,产生肌张力改变及运动协调障碍等一系列临床症状,是导致小儿脑性瘫痪的原因之一,可造成手足徐动型脑瘫,视听障碍、智力障碍等严重神经系统后遗症。本研究通过监测亚低温治疗不同时间窗内胆红素脑病仔兔脑基底节中DA、5-HT含量变化,探讨局部亚低温对胆红素脑病的神经治疗及保护作用,为临床新生儿胆红素脑病亚低温治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选用纯系新西兰仔兔112只,兔龄2～5 d,体重60～ 100 g,自然分娩,雌雄不拘,购自哈尔滨医科大学实验动物中心。将仔兔随机分为4组:常温对照组(NC):肛温=37℃,n=28;亚低温对照组(HC):肛温 =33.5℃,n=28;常温胆红素脑病组(NB):肛温=37℃,n=28;亚低温胆红素脑病组(HB):肛温=33.5℃,n=28。4组仔兔又随机分为0、6 h 、12 h 、24 h 组,每组各 7 只 。

1.1.2 试剂与仪器 胆红素(C33H36N4O6,分子量584.7):美国Sigma公司;DA、5-HT测试盒;二乙酸荧光素及国产分析纯或化学纯等。仪器有HDB-01贴敷式局部亚低温脑保护仪:哈尔滨工业大学热工教研室研制;SL24型针型点温传感器(Ø=1.15 mm);荧光分光光度计;高效液相色谱仪等。

1.2 方法

1.2.1 造模 向NB组和HB组仔兔腹腔注射胆红素200 μ g/g,NC组和HC组腹腔注射生理盐水1 ml。给药后恒温、恒湿、避光环境中配方乳哺育4 h。仔细观察仔兔神经行为变化。

1.2.2 亚低温治疗 HB和HC组于造模结束后立即应用HDB-01贴敷式局部亚低温脑保护仪治疗,降温帽置于仔兔头部,三维靶点降温,设定制冷温度为8℃,脑内制冷温度33.0℃[3],脑温过低采用60 W白炽灯加热,过高用冰袋降温,亚低温时间分别为0、6 h、12 h、24 h。停止降温后自然复温。观察治疗期间仔兔的一般状态。

1.2.3 取材 于相应时间点将仔兔用10%水合氯醛0.2 ml/100 g腹腔注射麻醉,经左心室插管入主动脉,生理盐水200 ml灌注,4%多聚甲醛磷酸盐缓冲溶液(pH=7.2;4℃)100 ml灌注固定。仔兔断头,冰盘下取出脑组织,剥离脑膜及大血管,以冷生理盐水冲洗数次,自脑组织矢状缝切开,一侧立即于-20℃冻存,用于测定脑基底节区DA、5-HT及胆红素含量。

1.3 5 -H T、DA及胆红素测定 脑基底节区组织匀浆,按试剂盒说明操作,采用荧光分光光度计在激发光波长365 nm、发射波长480 nm下测样品荧光强度,测定5-HT含量,在波长310/370 nm下测DA含量。胆红素采用重氮检测法:10倍体积冰醋酸匀浆,1500 r/min离心5 min,取上清液,再加等体积丙酮混匀,抽提、离心取上清液。各管分别加入重氮试剂,5 min后于波长540 nm下读取吸光度。

2 结果

2.1 神经行为观察 NC和HC组仔兔于麻醉苏醒后活动正常,吸吮有力,无异常神经行为活动,对外界刺激有灵敏的逃避反应。NB组仔兔造模结束后表现为兴奋、躁动和易激惹;6 h后出现俯伏,运动减少,对刺激反应迟钝,动作迟缓,平衡差,转圈,翻滚;12 h出现角弓反张,颤动,抽搐,不能步行;24 h出现四肢不能活动;2例死亡。HB组在亚低温治疗后12 h出现俯伏,运动减少,对刺激反应迟钝,动作迟缓,平衡差,转圈,翻滚;24 h对刺激反应较前灵敏,运动增加;未出现角弓反张,颤动,抽搐及不能步行;无死亡。

2.2 DA及5-HT变化 NB和HB组仔兔脑基底节中DA及5-HT含量于造模结束后与NC及HC组比较均明显降低(P＜0.01),两组间相比无显著性差异(P＞0.05)。HB组于治疗6 h、12 h、24 h时DA及5-HT含量与NB组比较均明显升高(P＜0.01),于24 h接近正常。见表 1、表2。

表1 不同时间仔兔脑基底节中DA含量(nmol/g)

2.3 胆红素变化 NB及HB组仔兔脑基底节中胆红素于造模结束后与NC及HC组比较均明显增高(P＜0.01),两组间比较无显著性差异(P＞0.05)。HB组经亚低温治疗6 h、12 h、24 h后,胆红素含量明显降低(P＜0.01)。见表3。

NB组脑组织中胆红素含量与DA含量高度负相关(r=-0.99,P＜0.01)。

表2 不同时间仔兔脑基底节中5-HT含量(nmol/g)

表3 不同时间仔兔脑基底节中胆红素含量(μ g/g)

3 讨论

近年来国内外一些研究证明,单胺类神经递质的代谢紊乱在胆红素脑病神经元损伤,尤其是迟发性神经元死亡中起重要作用[4]。在中枢神经系统内,单胺类神经递质的变化处于相对平衡状态,胆红素的神经毒性可以打破这种平衡状态。

Grojeans等发现,胆红素脑病时,游离胆红素使线粒体功能受损[5],细胞处于氧化应激状态,产生过多的氧自由基[6];氧自由基可随脑血流进入基底核区,对多巴胺及非多巴胺能神经元产生神经毒性作用,在此基础上激活小胶质细胞、启动炎症反应,导致神经营养因子的缺乏,最终引起进行性神经元变性死亡,造成多巴胺能神经元受损死亡[7]。而在残存的多巴胺能神经元中,因代偿作用使多巴胺的合成、代谢和更新的速率都加快,产生更多的氧自由基进一步加重氧化应激,增加多巴胺能神经元的损伤。当黑质多巴胺能神经元变性超过80%时,就会出现锥体外系的失调,失去对运动的自控能力[4]。

另外,中枢神经系统存在着5-HT能神经元。胆红素脑病时,脑干中缝核5-HT神经元变性、脱失,导致纹状体中5-HT减少及5-HT-组织胺系统失衡,使组织胺兴奋作用增强而产生临床症状,也表现为锥体外系症状。

动物实验证实,亚低温在海马、脑皮质、基底节、丘脑等处具有明显神经细胞保护作用[3]。近年来大量动物实验及临床研究表明,缺氧缺血后6 h内给予持续72 h的亚低温治疗,神经保护作用显著[8]。亚低温治疗有全身亚低温及局部亚低温,由于儿科尤其是新生儿涉及保温,所以多选择局部亚低温。目前亚低温治疗新生儿疾病尚处于早期临床研究阶段。周文浩等对24例中重度窒息足月新生儿进行头部亚低温治疗并对其安全性评价,证实亚低温治疗将体温维持在34.5℃左右,不会加重窒息新生儿心、肝、肾及血液、代谢等功能损害。本研究采用贴敷式局部亚低温治疗仪,所有实验动物均未出现硬肿、呼吸暂停等,动物吸吮能力及进奶量在各组间未见明显的差别,各组仔兔体重降低也不明显,从而也证明亚低温治疗的安全性。

文香淑等对单胺类神经递质在胆红素脑病动物体内的含量变化进行研究,证明胆红素脑病时,基底神经核区DA、5-HT含量下降,海马、脑干、皮层均有轻度降低,脑干区NE下降,海马、皮层、基底核NE均有下降趋势,但无统计学意义;基底核DA、5-HT含量与脑干NE含量呈线性正相关,基底节区DA含量与5-HT含量线性正相关,表明胆红素神经毒性可使基底节区DA、5-H T能神经元与脑干NE能神经元同时受到破坏,影响单胺类神经递质的合成、释放与摄取[9]。与本研究结论相似。本研究结果还显示,未经治疗的胆红素脑病脑组织内胆红素逐渐升高,并与脑组织DA负相关;表现为胆红素浓度依赖性和作用时间依赖性[10]。这也为神经行为学变化所证实。

本研究显示,贴敷式局部亚低温可以减轻胆红素对脑组织的神经毒性,减轻脑组织尤其是基底神经核区DA、5-H T能神经元的损伤,对脑组织具有保护作用,并可改善仔兔的神经行为异常。亚低温时间越长,效果越好。

目前认为,亚低温治疗时间越早预后越好,一般主张在发病后6 h内使用;使用亚低温治疗时间可根据病情维持2～5 d,一般主张不超过7 d。但国内也有报道因病情严重可应用14 d[8]。

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