云南松成熟合子胚的胚性愈伤组织诱导条件探究

王企珂，于大德，王 晟

（北京林业大学，北京 100083）

云南松（Pinus yunnanensis）广泛分布于我国四川西南部、云南、西藏东南部、贵州西部、广西西部等地。该树种喜光，耐干旱耐瘠薄，适应酸性的红壤、黄壤，在其他树种不能生长的贫瘠石砾地和冲刷严重的荒山坡地也能生长，是西南地区荒山造林的先锋树种。其木材是优质的造纸、人造板原料，具有较高的济价值。大量繁殖云南松，对保护这一我国特有树种并发挥其环境、经济方面的价值有着十分重要的意义。但由于松属植物本身的扦插繁殖困难，而种子繁殖速度慢、周期长、发芽率低，严重限制了其大规模繁殖。体外胚胎发生是一种重要、有效的无性繁殖手段，但在针叶树种中应用还不多，主要由于缺乏经济有效的组织培养方法[1～2]。

黄健秋等使用云南松成熟种子成功获得了云南松的完整小植株，但其培育时间较长，特别是胚性愈伤组织诱导率最高只有35.8%，转化率也比较低，其实验过程中，未探究对种子不同处理方法以及不同激素浓度配比对胚性愈伤组织诱导的影响[3]。本文探讨了使用云南松成熟种子诱导胚性愈伤组织的方法，使用正交实验设计，探究了不同的消毒方式及2,4-D与6-BA的不同浓度配比，对云南松成熟种子愈伤组织的诱导成功率的影响，为建立该树种离体培养技术的生物学基础，促进现代生物技术在其定向遗传改良中的应用等提供实验资料与数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

云南松成熟种子，于2009年11月购自中国林木种子公司，为2008年采收自云南昆明，干燥后一直密封保存于4℃冰箱。使用前先用流水冲洗干净，浮选法筛选出饱满健康的种子备用。

1.2 实验方法

1.2.1 外植体表面消毒与接种 云南松种子经流水清洗后放入培养皿移入超净台中，70%酒精消毒 30 s，无菌水冲洗2 ～ 3次。约100粒种子加入20 mL不同浓度的次氯酸钠溶液，浸泡20 min，无菌水冲洗2 ～ 3次，剥去种皮与胚乳，取出胚接种于培养基表面。诱导在锥形瓶中进行，每瓶接种5个胚，每个设计设置重复3次。在25±1℃下黑暗培养，每隔3 d观察记录。

1.2.2 使用正交设计诱导愈伤组织 本实验采用DCR培养基作为基础培养基，蔗糖浓度3%，琼脂0.6%，肌醇1 000 mg/L，CH 500 mg/L，pH值6.2 ～ 6.8。按照L9(34)正交实验设计，使用3%、5%、7% 3个浓度的次氯酸钠溶液对种子进行消毒，添加2,4-D的浓度为15、10、5 mg/L，6-BA的浓度为6、4、2 mg/L，共9组实验。

1.2.3 小梯度浓度激素配比诱导愈伤组织 在以上实验基础上，确定消毒液浓度，再在最佳的激素浓度附近选取3个较小的梯度浓度进行全交叉试验，以期得到更精确的激素浓度配比。2,4-D的浓度分别为8、10、12 mg/L，6-BA的浓度分别为1.0、1.5、2.0 mg/L。培养条件与上述实验相同。

1.2.4 愈伤组织形态学与细胞学观察 将完整愈伤组织置于实体显微镜下观察胚性愈伤组织外形，颜色等。细胞学观察采用压片法，将少许愈伤组织挑取到载玻片上，滴入少量清水用解剖针展开，轻轻压片观察。由于愈伤组织柔弱，壁薄，不可用力过度使细胞破裂。

2 结果与分析

2.1 愈伤组织诱导过程观察与胚性愈伤组织观察

接种后每3 d观察一次愈伤组织诱导情况，检查是否有污染，愈伤组织的产生部位、形态、大小、颜色，在2周后镜检。如有污染，在第3 d即可出现，根据表面形态可确认污染主要由黏菌与霉菌引起。

在培养基中培养3 d内，外植体明显变粗，子叶略微伸展开，但无萌发迹象，且表面光滑，无愈伤组织产生（图1）；培养4 ～ 5 d后，从胚根或下胚轴、子叶产生直径约2 mm的乳白色半透明粘状组织（图2），该组织在6 ～ 10 d内无明显变化，仅有少量的膨大（图3）；直到11 d后，开始加速膨大，并延胚轴向子叶方向延伸，到最后直径可达到1 cm以上；15 d后部分愈伤组织表面产生白色，透明丝状组织（图4），此时使用显微镜观察，可看到表面产生透明的圆丘状凸起（图5），而非胚性愈伤组织则无此结构。压片后可见细胞呈粗棒状，细胞核大，细胞质浓厚（图6），每一个细胞均有可能发育成为一个胚。有时在同一胚上可观察到两种愈伤组织：①下胚轴产生的浅黄、半透明丝状愈伤组织，结构松软，表面具有透明凸起；②主要由子叶产生，黄褐色或棕褐色，质地较坚硬，黄色，细胞排列紧密，较小。前者即为胚性愈伤组织。该愈伤组织在一定条件下诱导经过早期原胚—后期原胚—子叶胚阶段即可发育成为成熟的体细胞胚。

图1 接种3d内状态Figure1 The 3rd day of inoculation

图2 接种4 ～ 5d时状态Figure2 The 4th-5th day of inoculation

图3 接种6 ～ 10 d时状态Figure3 The 6th-10th day of inoculation

图4 接种15 d后状态Figure4 The 15th day of inoculation

图5 显微镜观察到愈伤组织表面透明凸起Figure5 Transparent structure on the surface of embryogenic callus under microscope

图6 涂片法观察到胚性愈伤组织细胞Figure6 Cell structure of embryogenic callus under microscope

在实验中还观察到一些胚的子叶在培养基中生长、变粗，长出小的凸起最终形成愈伤组织，但经观察确认并非胚性愈伤组织。这种情况在小浓度梯度实验中出现较少，主要是在 6-BA浓度较高的试验中出现。此外如果在剥出种子的过程中对胚根和胚轴，特别是下胚轴有损伤，则难以发育成为愈伤组织，而如果子叶有受伤，则仍可正常诱导出愈伤组织，说明胚的完整性对愈伤组织的诱导有一定的影响。

2.2 正交实验结果

重复3批实验后统计所得数据，得到实验结果（表1）。

表1 正交试验结果Table1 Result of orthogonal experiment

2.2.1 消毒剂浓度的选择 外植体消毒时间过短灭菌不彻底，造成污染，是组培实验需要极力避免的；而消毒时间过长则造成外植体活力降低甚至杀死外植体。在实验中曾观察到如果使用 7%的次氯酸钠溶液消毒时间过长，外植体接种后无论激素浓度与比例如何，均难以诱导出愈伤组织，且在接种后外植体不膨大也不生长，或者在培养一段时间后即从尖端枯萎。因此在选择浓度与消毒时间时需要综合考虑各个因素。

由表中数据可得，在消毒剂浓度过低时（3%），消毒效果不明显，平均有约20%的污染率。浓度较高时（5%、7%）效果较好，污染率大大减少，仅出现少量偶然的污染。同时为避免消毒剂浓度过高对种子活力的伤害，我们选择5%作为最佳的消毒剂浓度。

2.2.2 最佳激素浓度选择 愈伤组织的诱导率因不同激素浓度变化较大（见表1）。总的来说，在6-BA浓度较高时，愈伤得率均较低，此因素与愈伤得率呈显著相关性。在一定范围内，愈伤诱导率随着 2,4-D浓度提高而提高，但超过一定浓度则会降低。实验结果表明：第5组实验，即消毒剂浓度5%，2,4-D浓度10 mg/L，6-BA浓度2 mg/L为最佳实验组合，其愈伤诱导率为68.89%。

由于以上正交实验未得出在 2,4-D低浓度时，愈伤组织的诱导情况，且无法得到在最佳浓度附近组合对愈伤组织诱导率的影响，因此我们设计了小浓度梯度实验。

2.3 小浓度梯度实验结果

设计实验，在DCR培养基上添加2,4-D浓度分别为8、10、12 mg/L，6-BA浓度分别为1.0、1.5、2.0 mg/L配比，共9组，设置出小浓度梯度全交叉实验。其中以2,4-D 10 mg/L，6-BA 1.5 mg/L为最佳组合。

表2 小浓度梯度实验结果Table2 Result of small concentration gradient experiment

在小梯度诱导实验过程中，观察到有一部分愈伤组织产生的速度较快，但最终得到的愈伤组织比率与正交实验的第5号处理接近。实验结果确认了正交实验的结果，2,4-D浓度在一定范围内，诱导率与6-BA浓度的变化正相关；但浓度过高时（12 mg/L），诱导率随6-BA浓度升高而降低。表明激素在高浓度处理时对外植体会有一定毒害作用。

该全交叉实验还得到了6-BA作用的拐点。实验中还发现，2,4-D/6-BA的数值对实验结果有较大的影响，当2,4-D/6-BA的值较小时，特别是小于3时，诱导率均较低，通常不超过30%；而2,4-D/6-BA的值在4 ～ 5时，有较高的诱导率，均达到了50%以上，其中最高的可以达到近70%；之后随着比值继续升高，诱导率则略有下降，但都维持在30%以上。

3 讨论

通过以上实验证明，使用正交实验设计，使用DCR培养基，2,4-D与 6-BA作为激素诱导云南松成熟胚产生胚性愈伤组织是可行的。在先前的研究中，曾经得出使用DCR培养基作为基本培养基胚性愈伤组织的得率较低的结论[2]，但经过分析，我们认为DCR培养基也完全可以满足愈伤组织诱导的需要，且因为DCR培养基在针叶树种体胚发生中应用广泛，使用方便，因此仍决定使用该培养基。

外植体的灭菌是所有组织培养的重要环节，如果处理不当其结果将是灾难性的。组培实验中常用的灭菌剂有双氧水、次氯酸盐、酒精、升汞、抗生素等[4]，体胚发生中多选用升汞作为消毒剂，但由于抗生素对细菌真菌的抑制效果与抑制时间有限，而升汞含重金属，对人体有一定毒性，双氧水则需要较高浓度长时间才可达到效果。表面消毒的基本要求是既要杀死材料表面的全部微生物，又要不伤害材料，需要根据不同的材料，选取适当的消毒剂，合适的浓度和处理时间。综合考虑效果与环保，本试验按照前述的原则选择次氯酸钠作为消毒剂，选择灭菌时间15 min。

研究表明，胚性愈伤组织的诱导及体胚发生过程都与外植体的生理状态、培养基的营养成分、生长调节因子以及多个胚在培养中竞争性等因素关系密切[5]。只有合子胚发育到一定时期，才对外界培养环境有反应，其发育程度对胚性愈伤组织的诱导起决定性作用[6]。通常认为分化程度较低的组织，如未成熟胚，更有利于体细胞胚胎的诱导发生[7]。但未成熟胚的采集困难，受时间与地域限制较大，仅限于胚胎发育的某一时期才有较高诱导率，窗口期很短。因此使用成熟胚诱导愈伤组织是简化操作、降低成本的有效方法，且此方法可在大规模生产中较为方便地利用。

试验结果表明，2,4-D可启动细胞分裂，完成脱分化过程，因此 2,4-D是导致细胞进入细胞周期的关键因素[8～9]。2,4-D在一定浓度范围内，随其浓度增加，诱导率也增加，但生长素的浓度过高也会对胚性愈伤组织产生毒害作用[10]。在早期诱导中，细胞分裂素含量越高则诱导率越低，但过低也会影响诱导率，而在后期继代中，可适当提高细胞分裂素的比例，可以使愈伤组织较快地增殖。本实验采用成熟种子，可以周期性大量供应，无需限时采摘，相比使用未成熟种子来诱导，操作更简便，且成本更低，得到的诱导率也较黄健秋等人高。小浓度梯度的实验结果表明，激素浓度的细微调整对愈伤组织与胚性愈伤组织的诱导率均无较大影响，因此激素的比例是诱导率的主要影响因素，此结果与在杨树等其他植物的愈伤诱导上有相似之处。

有研究认为，不同品种间以及同一品种不同基因型之间，对胚性愈伤组织的诱导及后期胚胎发育方面都有很大差异[11]。在许多研究中使用了不同地区，不同环境下生长的同一物种进行诱导研究，结果差异显著。本实验通过比较云南松胚自然呈现的颜色区分，结果黄色胚与白色胚的诱导成功率分别在40%与60%左右。我们在实验中还发现有的愈伤组织可以抵抗较为不适宜的环境，在诱导培养基中1个月以上不继代，也不出现褐化且生长良好。这些愈伤组织可被筛选出来大量扩增，建立增殖体系。这种现象说明，基因型对愈伤组织的诱导与增殖确实有一定影响。在今后的应用中如何方便地筛选这样的基因型，是一个需要深入探究和解决的问题。

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