不同方法处理的金银花提取液在鸡胚内抗新城疫病毒作用

梁 尧,张钊伟,张瑞莉,葛 铭

(东北农业大学动物医学学院,黑龙江哈尔滨150030)

水提醇沉法是传统的中药澄清分离法,但是水提醇沉法有耗时、成本高、有污染及存在乙醇残留等缺点。因此又提出了高速离心法、壳聚糖絮凝澄清法等新方法[1-2]。高速离心法和壳聚糖絮凝澄清法具有省时、成本低、无污染及无药物残留等优点。但是这两种方法对中药提取液中有效成分是否有影响,对中药提取液在动物机体内的抗病毒效果如何,还未见有报道。本试验以金银花提取液为例,通过比较高速离心法、壳聚糖絮凝澄清法与水提醇沉法三种方法处理的金银花提取液在鸡胚内抗新城疫病毒作用研究,探讨3种中药澄清分离方法的优劣,为今后进行中药鸡胚抗病毒试验以及选择更合适的中药提取液的澄清分离方法提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 10日龄鸡胚,购自哈尔滨远大孵化场;鸡新城疫病毒(M uk teswar I系),由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所惠赠,EID50为10-4.5;金银花,购自哈尔滨中药大市场;壳聚糖,购自上海展云化工厂。

1.2 鸡红细胞悬液 参照《动物病毒学》[3]红细胞悬液的制备方法,配成体积分数为1%红细胞,现用现配。

1.3 壳聚糖絮凝剂制备 准确称取1 g的壳聚糖,用1%冰醋酸溶液溶解,定容至100mL。使配成含壳聚糖1%溶液,现用现配[4]。

1.4 金银花提取液制备 准确称取150 g的金银花,浸泡2 h,按常规方法煎煮,浓缩至150 mL。然后等分为3份,第1份金银花提取液12 000 r/min离心20 min,取上清液,用生理盐水定容至50 mL。第2份金银花提取液中缓慢加入3 mL 1%壳聚糖溶液,边加边搅拌,100 r/min搅拌10 min,50℃水浴12 h,3 000 r/min离心10 m in,取上清液用生理盐水定容至50 mL。第3份金银花提取液先用无水酒精配成含65%酒精的溶液,4℃冰箱保存过夜,过滤去除沉淀。蒸馏掉酒精,再加无水酒精至含85%酒精的溶液,4℃冰箱保存过夜,过滤去除沉淀,蒸馏去掉酒精,剩余液体用生理盐水定容至50 mL。把3种方法处理的金银花提取液用流通蒸汽法灭菌30 m in,4℃密封保存。

1.5 金银花提取液对鸡胚最大无毒浓度试验 将3种方法处理的金银花提取液用生理盐水按照1∶1,1∶2,1∶4,1∶8的浓度做倍比稀释,将不同稀释度的金银花提取液分别接种于10日龄鸡胚尿囊腔中,每枚鸡胚 0.2 mL,每个浓度设 5个重复,置37℃恒温箱内孵育,弃去24 h内死亡胚,活胚继续孵化直至出雏。

1.6 不同方法处理的金银花提取液在鸡胚内抗新城疫病毒试验 将3种方法处理的金银花提取液原液与100 EID50的新城疫病毒液按照不同方式接种于鸡胚尿囊腔内进行试验,具体方法如下：

接种方式1：将金银花提取液与等量的100 EID50新城疫病毒液混合后接种鸡胚尿囊腔内,每枚0.2 mL,每种方法处理的金银花提取液设5个重复。石蜡封口,37℃恒温箱孵化72 h,弃去24 h内死亡胚,测定鸡胚尿囊液的血凝效价。

接种方式2：先将100 EID50新城疫病毒液接种鸡胚尿囊腔内,每枚0.2 mL。2 h后再将金银花提取液接种鸡胚尿囊腔内,每枚0.2 mL,每种方法处理的金银花提取液设5个重复。石蜡封口,37℃恒温箱孵化72 h,弃去24 h内死亡胚,测定鸡胚尿囊液的血凝效价。

接种方式3：先将金银花提取液接种鸡胚尿囊腔内,每枚0.2 mL,每种方法处理的金银花提取液设5个重复。2 h后再给每枚鸡胚尿囊腔接种0.2 mL 100 EID50新城疫病毒液。石蜡封口,37℃恒温箱孵化72 h,弃去24 h内死亡胚,测定鸡胚尿囊液的血凝效价。

以上试验同时设立病毒及生理盐水对照。

1.7 数据处理 采用SPSS软件进行数据处理,分析各组间差异。

2 结果

2.1 金银花提取液对鸡胚最大无毒浓度见表1。

经过重复试验,3种方法处理的金银花提取液原液及稀释液对鸡胚均无明显致死作用,鸡胚全部存活。

2.2 3种方法处理的金银花提取液在鸡胚内抗新城疫病毒结果见表2。

表1 金银花提取液对鸡胚最大无毒浓度试验结果

表2 金银花提取液在鸡胚内抗新城疫病毒试验结果

由表2可见,病毒对照组的鸡胚全部死亡,生理盐水对照组和接种金银花提取液组的鸡胚全部存活;新城疫病毒和金银花提取液在接种方式1中的鸡胚血凝效价与病毒对照组的鸡胚血凝效价比较,差异极显著(P＜0.01);在接种方式2中的鸡胚血凝效价与病毒对照组的鸡胚血凝效价比较,差异显著(P＜0.05);在接种方式3中的鸡胚血凝效价与病毒对照组的鸡胚血凝效价比较,差异显著(P＜0.05)。

3 讨论

3.1 在本试验中,病毒对照组的鸡胚全部死亡,而生理盐水对照组和接种金银花提取液组的鸡胚均全部存活,一方面说明金银花提取液有良好的抗新城疫病毒作用;另一方面说明3种澄清分离方法均能有效的的去除金银花提取液中的大分子物质,金银花提取液澄清度良好,没有引起鸡胚过敏反应。

同时在试验中,新城疫病毒和金银花提取液接种方式1和方式2中,高速离心法和壳聚糖絮凝澄清法处理的金银花提取液抗新城疫病毒作用与水提醇沉法处理的金银花提取液抗新城疫病毒作用相同;在接种方式3中,高速离心法和壳聚糖絮凝澄清法处理的金银花提取液抗新城疫病毒作用略好于水提醇沉法处理的金银花提取液。可见高速离心法和壳聚糖絮凝澄清法不仅具有省时、成本低、无污染及无药物残留等优点,而且还能有效的保留金银花提取液中有效成分,具有和水提醇沉法处理的金银花提取液同样的抗新城疫病毒作用。

3.2 本试验只是比较了3种澄清方法处理的100%浓度的金银花提取液在鸡胚中的抗新城疫病毒作用,但是3种方法处理的金银花提取液在稀释后是否具有同样的抗新城疫病毒作用,还有待进一步研究。

[1] 殷士海,苏瑞强,朱喃风,等.中药澄清分离技术的应用与发展[J].中国药业,1999,8(11)：56-57.

[2] 王海军,罗维早.吸附澄清剂在中药提取分离中的应用[J].重庆中草药研究,2006,12(2)：30-33.

[3] 殷震,刘景华.动物病毒学[M].北京：科学出版社,1997：479-499.

[4] 陈浩,田景振.吸附澄清技术[J].山东中医杂志,2000,19(3)：176-179.