三七消散丸质量标准研究

李素梅,江志强,孙冬梅,罗文汇,范宋玲

(1.广州中医药大学,广东 广州510405;2.广东省中医研究所,广东 广州510095)

三七消散丸由三七、白花蛇舌草、夏枯草等药物组成,具有化瘀解毒、软坚散结的功效,主要用于各类肿块、痰火凝结之瘰疬及痰核等。为了更好地控制其质量、保证临床疗效,本研究采用薄层色谱法对制剂中的三七、白花蛇舌草、夏枯草进行定性鉴别,并采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法对制剂中三七所含三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1进行了含量测定。

1 仪器、试剂与试样

1.1 仪 器

Camag Tlc Sampler4型自动点样仪,瑞士Camag公司产品;Camag Reprostar3 薄层成像系统,瑞士Camag公司产品;Agilent1200高效液相色谱仪,美国安捷伦科技有限公司产品;Alltech3300蒸发光散射检测器,美国格雷斯奥泰公司产品;SartoriusBP211D电子分析天平,德国赛多利斯公司产品;KQ5200 DE型数控超声波清洗器,上海楚定分析仪器有限公司产品;电热恒温水浴槽,上海精宏实验设备有限公司产品;DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱,上海精宏实验设备有限公司产品;PBQ-Ⅱ型薄层自动铺板器,重庆南岸新力实验电器厂产品。

1.2 试剂与试样

白花蛇舌草对照药材(批号121183-200402)、夏枯草对照药材(批号120993-200604)、三七皂苷R1对照品(批号110745-200415)、人参皂苷Rg1对照品(批号110703-200726)及人参皂苷Rb1对照品(批号110704-200420),均购自中国药品生物制品检定所;三七消散丸,由广东省第二中医院制剂室提供,批号20090302, 20090303, 20090304;乙腈为进口色谱纯,美国Honeywell公司产品;水为屈臣氏蒸馏水,广州屈臣氏食品饮料有限公司产品,批号20090103;正丁醇,天津大茂化学试剂厂产品,批号20090408;甲醇(批号20090220)、乙酸乙酯(批号20081009)、石油醚(30～60 ℃,批号20090301)、乙醚(批号20081206)及氨水(批号20090302-1),均为广州化学试剂厂产品;无水乙醇(批号20081203),天津大茂化学试剂厂;其他试剂均为分析纯。

2 定性鉴别

2.1 三七的薄层色谱鉴别

取本品 2 g, 研细, 加石 油醚(30～60 ℃)50 mL,加热回流30 min,弃去石油醚液;药渣挥干后,加水饱和正丁醇20 mL,超声处理30 min;滤过;滤液加氨试液洗涤两次,每次20 mL;弃去氨试液,正丁醇液蒸干;残渣加甲醇2 mL使溶解,作为供试品溶液。另取三七对照药材0.5 g,加水饱和正丁醇20 mL,超声处理30 min,同法制成对照药材溶液。再按处方比例,取缺三七的其他各味药,按制备工艺加工制成阴性样品,按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录Ⅵ B)实验。吸取上述3 种溶液各2 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上;以正丁醇-乙酸乙酯-稀氨水(5→50)(4∶1∶5)上层液为展开剂,置于氨蒸气饱和的展开缸内展开;取出,晾干;喷以10%硫酸乙醇溶液;于105 ℃烘至斑点显色清晰;置于紫外光灯(365 nm)下检视。结果:供试品色谱在与对照药材色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点。

2.2 白花蛇舌草的薄层色谱鉴别

取本品3 g,研细,加水100 mL,煮沸30 min,滤过,滤液浓缩至约30 mL,加乙酸乙酯萃取两次,每次20 mL,合并乙酸乙酯液,蒸干,残渣加甲醇2 mL使溶解,作为供试品溶液。另取白花蛇舌草对照药材1 g,加水100 mL,煮沸30 min,同法制成对照药材溶液。再按处方比例,取缺白花蛇舌草的其他各味药,按制备工艺加工制成阴性样品,按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录Ⅵ B)实验,吸取上述3种溶液各8 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上;以三氯烷-甲醇-乙酸(9︰2︰0.05)为展开剂展开;取出,晾干;喷以10%硫酸乙醇溶液,于105 ℃烘至斑点显色清晰。结果:供试品色谱在与对照药材色谱相应位置上显相同颜色的斑点。

2.3 夏枯草的薄层色谱鉴别

取本品5 g,研细,加水100 mL,煮沸30 min,滤过,滤液浓缩至约30 mL,加盐酸调pH值为2～3,加乙醚振摇提取3次,每次20 mL,合并乙醚液,蒸干,残渣加无水乙醇1 mL使溶解,作为供试品溶液。另取夏枯草对照药材1 g,加水100 mL,煮沸30 min,滤过,同法制成对照药材溶液。再按处方比例,取缺夏枯草的其他各味药,按制备工艺加工制成阴性样品,按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法(《中国药典》 2005年版一部附录Ⅵ B)实验,吸取上述3种溶液各10 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上;以甲苯(水饱和)-乙酸乙酯-甲酸(8∶4∶1.2)为展开剂展开;取出,晾干;喷以5%三氯化铁乙醇溶液, 105 ℃烘至斑点显色清晰。结果:供试品色谱在与对照药材色谱相应位置上显相同颜色的斑点。

3 定量分析

参照文献[1]方法进行。

3.1 对照品溶液的制备

精密称取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1 适量, 加甲醇制成每毫升含三七皂苷 R1 0.106 2 mg、人参皂苷Rg1 0.489 6 mg、人参皂苷Rb1 0.390 4 mg的混合液。

3.2 供试品溶液的制备

取本品适量,研细,取约2.0 g,精密称定;置索氏提取器中,加石油醚(30～60 ℃)水浴上回流提取1 h;弃去石油醚(30～60 ℃)液;药渣挥干溶剂后,再加甲醇回流提取4 h;滤过;滤液蒸干,残渣加水15 mL使溶解;加水饱和正丁醇振摇提取3次,每次20 mL;合并正丁醇液;用氨试液洗涤两次, 每次30 mL;弃去氨试液;正丁醇液蒸干;残渣加甲醇使溶解;转移并定容至25 mL量瓶中;加甲醇定容至刻度,摇匀,备用。

3.3 阴性对照溶液的制备

按处方比例,取缺三七的其他各味药,按制备工艺加工制成阴性样品,按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。

3.4 色谱条件与系统适应性条件

色谱柱:HpersilODS柱(250 mm×4.0 mm,5 μm);柱温30 ℃;流动相内乙腈-水, 梯度洗脱(0～12 min,乙腈 19%→36%;12～21 min, 乙腈36%);流速 1 mL/min;ELSD检测器漂移管温度45 ℃;载气流速1.5 L/min。在上述色谱条件下,三七皂苷R1、人参皂苷Rg1 及人参皂苷Rb1三者能较好地分离。见图1。

图1 三七消散丸HPLC-ELSD图

3.5 线性关系考察

分别精密吸取对照品溶液4, 5, 6, 8, 10 μL注入液相色谱仪,以峰面积的自然对数为纵坐标,以进样量(μg)的自然对数为横坐标进行线性回归,得回归方程,结果见表1。

表1 对照品回归方程

结果表明:三七皂苷R1在 0.424 8～1.062 0μg、人参皂苷Rg1在1.958 4～4.896 0 μg、人参皂苷Rb1在1.561 6～3.904 0 μg之间,其自然对数值与峰面积自然对数值呈良好的线性关系。

3.6 精密度实验

精密吸取供试品溶液(批号20090302)5 μL,重复进样6次,三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1平均峰面积及峰面积RSD见表2～4。

表2 三七皂苷R1精密度实验结果

表3 人参皂苷Rg1精密度实验结果

表4 人参皂苷Rb1精密度实验结果

3.7 稳定性实验

分别精密吸取同 1 份供试品溶液(批号20090302)5 μL,分别于0, 2, 4, 8, 12 h进样5 μL,按3.4项下色谱条件进行测定,结果三七皂苷R1、人参皂苷 Rg1 及人参皂苷Rb1 峰面积 RSD分别为1.12%、0.95%、0.85%。表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

3.8 重现性实验

取供试品(批号20090302)5份,分别按照3.2项下方法制备供试品溶液,并按照上述色谱条件进行测定。结果:三七皂苷R1 平均含量为 2.35 mg/g,RSD=1.09%;人参皂苷Rg1平均含量为8.85 mg/g,RSD=1.01%;人参皂苷Rb1平均含量为6.84 mg/g,RSD=0.98%。表明该方法重现性好。

3.9 加样回收率测定

取6 份已知含量的样品(批号 20090302)约1.0 g,精密称定质量,分别精密加入一定量的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1对照品,按3.2项下供试品制备方法处理,进样5 μL,按3.4项下色谱条件进行测定,计算回收率,结果见表5～7。

表5 三七皂苷R1加样回收率实验结果 n=6

表6 人参皂苷Rg1加样回收率实验结果 n=6

表7 人参皂苷Rb1加样回收率实验结果 n=6

3.10 供试品测定结果

分别精密吸取对照品溶液5 μL、10 μL及供试品溶液5 μL,注入液相色谱仪,用外标两点法计算,即得。结果见表8。

表8 供试品含量测定结果 n=3

4 讨 论

三七中所含的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1均为四环三萜皂苷类成分,其最大吸收波长在203 nm左右,在紫外区属于末端吸收,在分析过程中往往会受到溶剂干扰,噪音信号大,灵敏度较低,采用紫外检测器时,样品分离度差,分析时间长,较难获得满意结果。蒸发光散射检测器为一种质量通用型检测器,它的响应不依赖于样品的光学特性,任何挥发性低于流动相的样品均能被检测。本文采用高效液相色谱法-蒸发光散射检测器,参照文献[1]中三七药材含量测定流动相,并加以调整,建立了三七消散丸中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1的含量测定方法,并通过方法学考察验证,结果显示,该含量测定方法简便、准确,精密度好,能够准确测定样品中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1含量。

本文所确定的方法简便、快速、重现性好、准确可靠,可作为三七消散丸的质量控制方法。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[ M].北京:化学工业出版社, 2005:10-11.