基于满秩平行因子分析方法研究左氧氟沙星两种结构型体的荧光光谱及其与酸碱度的关系

郭嘉伟, 谢洪平

(1第三军医大学药学院药物分析与分析化学教研室, 重庆 400038; 2苏州大学药学院药物分析教研室; *通讯作者:E-mail:breakhp@163.com)

左氧氟沙星,以其抗菌活性强、抗菌谱广、高效等特点,是目前最受欢迎的氟喹诺酮类抗菌药物之一。其分子结构存在有 C-4羰基氧,C-3羧基,另外还有哌嗪基团,因此其理化性质必然会受到介质的理化性质和pH的影响。随着介质 pH的改变,左氧氟沙星会产生不同的结构变化,结构变化又会使其荧光光谱发生改变[1]。近年来,已经有报道利用一些荧光分析方法对左氧氟沙星在不同 pH环境中的不同结构形态进行了研究[2-5],但是这些研究仅能获取不同结构形态药物的混合物光谱,往往进行一些间接的推论,未能阐述这些不同结构形态的具体变化过程,同时也不能直接获得各结构形态的光谱和浓度变化信息。本文利用荧光分光光度法对不同pH值下的左氧氟沙星溶液进行三维荧光分析,并以满秩平行因子分析方法(full rank parallel factor analysis,Full-PARAFAC)对相应的三维阵列数据进行分辨,达到对不同 pH环境下左氧氟沙星各种结构型体荧光光谱和浓度变化进行研究的目的,为左氧氟沙星的药动学和药效学研究提供更科学的信息。

1 仪器与试剂

左氧氟沙星(含量 99%,苏州长征制药厂提供),磷酸二氢钾,磷酸氢二钾,氢氧化钠,盐酸 (国药集团化学试剂有限公司)。所有药品均为分析纯,双蒸水(自制)。

LS-55荧光分光光度计(Perkin Elemer公司),pHS-3TC精密数显酸度计(上海精密科学仪器有限公司)。

2 方法

2.1 样本制备 以左氧氟沙星、KH2PO4,K2HPO4,NaOH和HCl(0.01 mol/L)配制了 pH值分别为2.78,3.54,4.21,4.71,5.16,5.76,6.57,6.84,7.02,7.26,7.43,7.62,7.83的13个待测样本。

2.2 光谱条件 对所配制的不同 pH值的待测样本分别扫描其三维荧光谱图,光谱条件为:激发波长290-360 nm,步长增加 5 nm;发射波长410-560 nm,扫描次数 15次;激发与发射的狭缝宽度均为5 nm。

3 结果

3.1 左氧氟沙星在不同 pH值下的三维荧光光谱在样品的三维荧光谱图中可以观察到,随着 p H值的改变,左氧氟沙星溶液发生了荧光特征变化,荧光发射峰发生了明显的蓝移(见图1),此现象说明在不同 pH环境下此药物可能存在不同的结构型体。基于文献[3],发现它们可能是氢键结构(the hydrogen bond structure,HDS)和双极离子结构(the dipole ion structure,DIS)两种型体,但由于两种结构型体之间存在显著的化学平衡和弱化学键的结构,难于分离,当然更无从得到其纯光谱。

图1 左氧氟沙星在pH 2.78,pH 5.16和pH 7.83溶液中的三维荧光光谱Fig 1 The three dimensional fluorescence spectrum of levofloxacin in the pH 2.78,pH 5.16and p H 7.83 solution

3.2 Full-PARAFAC分辨结果 用 Full-PARAFAC方法对三维数据阵列进行分辨,得到了左氧氟沙星两个结构型体的光谱(图2)以及相应的浓度变化曲线(图3)。图2中 290-360 nm范围内的光谱为激发光谱,400-560 nm范围内的光谱为发射光谱。从图3可以观察到,两种结构型体浓度之和的变化趋势依据 pH值可分为三个阶段:分别为pH2.78-5.76,pH5.76-7.02和pH7.02-7.83。

图2 左氧氟沙星 HDS(●)和DIS(▲)的激发光谱和发射光谱(实线:分辨光谱;虚线:p H值 2.78的实际光谱)Fig 2 The excitation and emission spectra of HDS(●)and DIS(▲)for levofloxacin(line:resolution spectra;dash line:real spectra of p H 2.78)

图3 HDS(●)、DIS(▲)和HSD+DIS(■)的浓度变化曲线Fig 3 The concentration variation curves of HDS(●),DIS(▲)and HDS+DIS(■)

4 讨论

4.1 三维光谱数据处理 通过扫描获得了 13个样本的激发-发射光谱,组成了(15′292′13)的三维数组,但由于其发射光谱数据过于紧密,将导致数据处理量大大增加,而信息量并未显著提高,因此,本文参照激发光谱,将5 nm的间隔也用于发射光谱,从而使三维数组的维数从(15′292′13)降低为(15′29′13),并以此数据进行三维分辨。

4.2 HDS和DIS的荧光光谱及浓度变化 由于在不同的pH环境中,左氧氟沙星会产生不同的结构变化,偏酸性条件下,分子中的羧基氧结合质子,并与 4位 C羰基氧相连,形成氢键,此时溶液中 HDS结构型体占主要比例;而随着 pH值的升高,分子内氢键逐渐被破坏,具有氢键结构的HDS型体逐渐减少,以双极离子形式存在的结构型体浓度逐渐升高。从图3可以看出,与图2光谱 1相对应组分的浓度随 pH的升高逐渐减少,而光谱 2组分的浓度却随pH的升高逐渐增加。因此,在所得到的左氧氟沙星两个组分的纯光谱中,光谱 1应为HDS结构型体的激发与发射光谱,而光谱 2为DIS结构型体的纯光谱。为了说明以上的结论,对所得 HDS的发射光谱与实际光谱进行了比对。当 pH为2.78时,HDS型体的浓度最高,而 DIS型体的浓度几乎为零,因此,这时的实际光谱就应当为型体 HDS的荧光光谱。在 pH2.78的三维荧光光谱图中,取最大激发/发射对294 nm/501 nm处的谱线数据归一化后,与分辨得到的结构型体 HDS的发射光谱进行对比,发现二者完全重合(见图2)。从而进一步证明了上述的实验结论,亦间接证明了分辨图中的第二条曲线应为结构型体 DIS的荧光光谱。

在获取 HDS和DIS两种型体纯光谱的同时,也得到了两者的浓度变化趋势。由图3可知,随着 p H值的升高,以氢键形式(HDS)存在的结构型体逐渐减少,而以双极离子形式(DIS)存在的结构型体逐渐增多。HDS和DIS两种结构型体的总量也逐渐减少。同时 HDS和DIS的总浓度的变化呈现三个阶段,即在 pH2.78-5.76范围内稳定,在 pH5.76-7.02范围内相对稳定,而在 pH7.02-7.83范围内明显下降。

5 结论

本文对不同 pH环境下左氧氟沙星的三维荧光光谱进行了研究,发现在 pH值 2.78-7.83的范围内,左氧氟沙星的三维荧光光谱会发生规律性的变化:2.78≤pH≤5.16时,荧光发射峰逐渐蓝移,荧光强度基本保持不变;5.16＜pH≤7.83时,荧光峰大幅度蓝移,荧光强度逐渐降低。在溶液中,当 p H值发生改变时,左氧氟沙星存在着不同结构型体之间的离解平衡,因此,利用 Full-FARAFAC分析方法得出了 pH值 2.78-7.83范围内两种结构型体 HDS和DIS的纯荧光光谱和浓度变化曲线,两种结构型体的浓度之和变化呈现出三个阶段:p H2.78-5.76范围内稳定,pH5.76-7.02范围内相对稳定,pH 7.02-7.83范围内明显下降。基于研究结论可知,在生理 pH环境中,左氧氟沙星应当也存在 HDS和DIS这两种结构型体,随着 pH的变化,这两者在体内的浓度比例亦会产生变化,而本文中 HDS和DIS两种结构型体纯光谱的获得,即相当于获得了两种结构型体的对照品,通过对分析结果中的光谱进行比对,不仅使生物样品中左氧氟沙星两种结构组分的检测和浓度测定成为可能,更对左氧氟沙星药物代谢和动力学研究提供了更可靠的信息支持。

[1] 刘明亮.喹诺酮类抗菌药在不同介质中的理化性质[J].国外医药:抗生素分册,2006,27(1):22-34.

[2] Drakopoulos AI,Ioannou PC.Spectrofluorimetric study of the acidbase equilibria and complexation behavior of the fluoroquinolone antibiotics ofloxacin,norfloxacin,ciprofloxacin and pefloxacin in aqueous solution[J].Analytica Chimica Acta,1997,354:197-204.

[3] 刘翠格,徐怡庄,魏永巨,等.氧氟沙星的荧光光谱与质子化作用研究[J].光谱学与光谱分析,2005,25(4):584-587.

[4] 张国文,潘军辉,黄璞,等.乳酸左氧氟沙星的紫外光谱性质与应用[J].南昌大学学报:理科版,2004,28(3):240-242.

[5] Park HR,Kim TH,Bark KM.Physicochemical properties of quinolone antibiotics in various environments[J].Eur J Med Chem,2002,37(6):443-460.