补充香菇多糖对长期大负荷运动小鼠免疫调节作用

史亚丽 蔡德华 王晓洁 杜蓉

1鲁东大学体育学院（烟台 264025） 2鲁东大学食用菌工程研究中心 3鲁东大学生命科学院

香菇（Lentinus edodes）含有多种有效药用组分，尤其是香菇多糖（Lentinan，LNT）。它是一种重要的生物反应调节剂，通过刺激免疫细胞成熟、分化和增殖，改善宿主机体平衡，达到恢复和提高宿主细胞对淋巴因子、激素和其它生理活性因子的反应性[1，2]。LNT对提高运动机体免疫力方面的研究尚未见报道。本实验对长期进行大负荷运动小鼠灌胃LNT，观察补充LNT对运动小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力、血清抗体相对含量及体外抗体形成细胞数量（体液免疫）的影响，探讨补充LNT对长期大负荷运动小鼠的免疫调节作用，为其作为运动营养补品的研究开发提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

清洁级昆明种小鼠120只，雄性，18～22g，山东绿叶制药股份有限公司实验动物中心提供，动物合格证号:SYXK（鲁）20030020。一级白色豚鼠，体重 300～400g，山东中医药大学提供，动物合格证号:SCXK（鲁）20050015。小鼠分笼饲养，每笼5只，自由饮食，国家标准啮齿类动物常规饲料喂养。动物饲养环境23℃±2℃，湿度40%～60%，自然昼夜节律。

1.2 动物分组与处理

120只小鼠适应性喂养3天后，随机分为安静对照组（C）、运动组（T）、盐水 +运动组（S+T）、高剂量 LNT+运动组（HL+T）、中剂量 LNT+运动组（ML+T）、低剂量LNT+运动组（LL+T），每组20只。实验后期死亡14只，T组死亡 3只，S+T组 4只，HL+T组 2只，ML+T组 2只，LL+T组3只。灌胃及训练结束后将每组小鼠随机分为a、b两小组，a小组进行巨噬细胞吞噬功能的测定，b小组用作血清凝集效价（抗体相对含量）测定及体外抗体形成细胞数量测定。

1.2.1 运动条件

塑料游泳池，100cm×60cm×50cm，水深40cm，超过小鼠体长2倍，水温32～34℃。

1.2.2 训练方案

C组:不进行运动训练，只进行正常的生理活动。T、S+T、HL+T、ML+T、LL+T各组小鼠进行 5%负重游泳训练，持续4周，6次/周，周日休息。第一周从20min开始负重游泳，以后每日增加5min直至45min/日，运动时间不足45min就发生力竭的小鼠迅速捞起，擦干身体休息5min后再放入水中继续游泳，训练时间累计须达到45min/次。训练结束后，迅速用电吹风吹干身体。

1.3 补充方法

1.3.1 香菇多糖的提取

香菇由鲁东大学食用菌工程研究中心提供。子实体50℃烘干、粉碎、称重、热水浸提、过滤、滤液醇沉得多糖[3]。多糖含量测定方法参照文献[3]。

1.3.2 补充方法

采用灌胃法，HL+T组每日剂量400mg/kg，ML+T组200mg/kg，LL+T组 100mg/kg。用生理 盐水 配制 成400mg/10ml、200mg/10ml、100mg/10ml的 LNT 盐水溶液，每日0.2ml剂量灌胃，S+T组灌胃等体积生理盐水。1次/d，时间为4周。

1.4 指标测定

1.4.1 巨噬细胞吞噬功能的测定

可溶性淀粉6g加入肉汤培养液100ml中，混匀，煮沸灭菌备用。a小组每只小鼠腹腔注射6%可溶性淀粉，1ml/只，当日停止训练，继续灌胃。3日后于小鼠腹腔注射5%鸡红细胞悬液0.2ml，轻柔腹部，注射后30min于小鼠腹腔注射生理盐水1ml，轻柔腹部数次。采集腹水:取小鼠自然站立位。在耻骨前缘，腹中线两侧剪毛、消毒，浸润麻醉，紧绷穿刺部位皮肤，作垂直穿刺。用注射器慢慢回抽，滴1滴于洁净载玻片上，推成薄片，晾干后甲醇固定4～5min。滴加瑞士－吉姆萨染液，染色3min，流水冲洗，自然晾干，油镜下观察。随机计数100个巨噬细胞，记录并计算吞噬率和吞噬指数。吞噬指数=100个巨噬细胞所吞噬的鸡红细胞总数／100；吞噬率=100个巨噬细胞中吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数／100×100%[4]。

1.4.2 血清凝集效价（抗体相对含量）和体外抗体形成细胞（PFC）测定（脾脏溶血空斑形成）

于灌胃及训练结束前第4天，b小组每只小鼠腹腔注射5%SRBC悬液0.2ml致敏，以生成抗体形成细胞及产生抗体，继续灌胃及训练。

（1）血清凝集效价（抗体相对含量）测定:灌胃及训练结束后，将b小组小鼠头朝下，断颈采血，血液37℃水浴放置2h，转入冰箱放置2h，分离血清，进行抗体凝集反应[4]，测定血清凝集效价。

（2）体外抗体形成细胞（PFC）测定:按文献[5]制备豚鼠血清。将b小组小鼠脾脏用生理盐水制成1×107/ml脾细胞悬液，取0.1ml脾细胞悬液和5%SRBC悬液，迅速保温于47℃水浴中的3.5ml浓度为0.7%琼脂糖管内，摇匀后立即将混合物倾入铺有底层琼脂糖凝胶的平皿内，轻摇使其铺开，待琼脂凝固后，37℃孵育1h。每皿加入 1∶10稀释的豚鼠血清2ml为补体，使其均匀覆盖表面。37℃孵育30min，室温放置1h，4℃冰箱过夜，次日倾去补体，低倍镜下观察，空斑中央为淋巴细胞，周围为透明区。计数每皿空斑数，单位为个/106脾细胞[4]。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力

4周大负荷的运动训练后，T组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率、吞噬指数较C组明显降低。中、高剂量LNT+运动组小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬率显著高于盐水+运动组和低剂量LNT+运动组，中剂量LNT+运动组小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬指数显著高于盐水+运动组和低剂量LNT+运动组。

表1 各组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力比较

2.2 小鼠血清凝集效价、体外抗体形成细胞数量

4周大负荷的运动训练后，T组血清凝集效价、体外抗体形成细胞数较C组明显降低。低、中、高剂量LNT+运动组小鼠血清凝集效价均显著高于盐水+运动组，中剂量LNT+运动组小鼠血清凝集效价显著高于低剂量LNT+运动组；中剂量LNT+运动组小鼠体外抗体形成细胞数显著高于盐水+运动组和低剂量LNT+运动组。

表2 各组小鼠血清凝集效价、体外抗体形成细胞数量比较

3 讨论

运动训练对免疫系统及其功能的影响可归纳为两方面:急性短时中等强度运动激活免疫系统并提高免疫功能，长时间耐力运动或长期强化性训练则抑制免疫功能[6]。力竭运动可抑制腹膜巨噬细胞MHCⅡ的表达，进而影响巨噬细胞的抗原呈递作用，抑制巨噬细胞的功能[7，8]。大强度运动后B细胞合成和分泌免疫球蛋白的功能出现明显改变，以75%VO2max强度运动1h，合成与分泌IgG、IgA、IgM等免疫球蛋白的细胞功能在运动过程中和运动结束后明显降低[6]。本实验结果显示，运动组小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬率、吞噬指数、血清凝集效价、体外抗体形成细胞数量均显著低于对照组，表明长期大负荷运动小鼠处于运动性免疫抑制状态。

LNT是一种免疫激活剂，能激活巨噬细胞和淋巴细胞，提高巨噬细胞的趋化性和淋巴细胞对Yac-1细胞和P-815细胞的毒性反应水平[9]。香菇是诱生α-干扰素较明显的一种真菌，LNT能活化CD4+淋巴细胞，促使CD4+增殖和IL-2R表达[10]。LNT可活化T细胞，并对免疫巨噬细胞起诱导和增强作用，使免疫状态由低下恢复到接近于正常。本研究结果显示，补充中、高剂量LNT均可使长期大负荷运动小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬率明显提高，中剂量LNT可使长期大负荷运动小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬指数升高且效果明显好于低剂量LNT。低、中、高剂量LNT均可使长期大负荷运动小鼠血清凝集效价明显提高，中剂量LNT效果明显好于低剂量LNT，中剂量LNT可明显提高长期大负荷运动小鼠体外抗体形成细胞数且其效果明显好于低剂量LNT。

综上，4周大负荷运动可以导致小鼠运动性免疫抑制。补充LNT可使长期大负荷运动小鼠非特异性及特异性免疫功能得到改善，其中，中剂量LNT补充效果明显。

[1]芳积年，王顺春.香菇多糖的研究进展.中国药学杂志，1997，3（6）:332-334.

[2]刘栋，钱建亚，卜敏.香菇多糖抗肿瘤作用研究现状.中国食用菌，2002，22（2）:6-7.

[3]张惟杰.复合糖生化技术.上海:上海科学技术出版社，1987.13-15.

[4]司传平.医学免疫学实验.北京:人民卫生出版社，2005.15-17，71-72，74-76.

[5]吴端生，张建.现代实验动物学技术.北京:化学工业出版社，2007.285-286.

[6]张爱芳.实用运动生物化学.北京:北京体育大学出版社，2005.378.

[7]Ceddia MA，Woods JA.Exercise suppresses macrophage antigen presentation.J Appl Physiol，1999，87（6）:2253-2258.

[8]Ceddia MA，Voss EW Jr，Woods JA.Intracelluar mechanisms responsible for exercise-induced suppression of macrophage antigen presentation.J Appl Physiol，2000，88（2）:804-810.

[9]Kurashige S，Akuzawa Y，Endo F.Effects of Lentinus edodes，Grifola frondosa and Pleurotus ostreatus’administration on cancer outbreak，and activities of macrophages and lymphocytes in mice treated with a carcinogen，N-butyl-N’-butanolnitrosoamine. Immunopharmacol Immunotoxicol，1997，19（2）:175-183.

[10]万克青.香菇多糖注射液对慢性活动型肝炎外周血T淋巴细胞亚群和IL-2R表达作用的研究.中国免疫学杂志，1995，11（5）:298-299.