新的微生物方法在石油生产中的应用

编译:梁双庆 (大庆石油学院)审校:王洋 (大庆石油学院)

新的微生物方法在石油生产中的应用

传统微生物学的培养基方法应用于微生物工艺会引起油田的酸化和微生物腐蚀,从而产生不适应和矛盾的结果。任何培养步骤都几乎可以改变种群特征,因此也就改变了任何评价都要使用的基础结论。在过去10年里,独立培养方法的发展为鉴别微生物特征、数量和在一定程度上确定其功能的各种分析方法提供了方便,可直接用于本源微生物种群。然而,发展至今其实际应用相当局限,直至最近才应用于海洋工业。文章给出了这些新技术的特性和它们应用于北海海洋石油生产经常遇到的两种情况的优势——硝酸盐注入和微生物腐蚀。微生物工具是建立于对微生物的遗传物质检测的基础上。方法包括直接用显微镜观察荧光原位杂交和直接提取细胞遗传物质来计算具体微生物种群的数量,例如定量聚合酶链反应和变性梯度凝胶电泳。文章简要描述了这些相对新的分子技术。在硝酸盐处理的储层中,微生物种群的改变引起水的突进,可以鉴别关键微生物种群,因此,产生对引起体系酸化的微生物新的强化检测方法。分子技术是最有力的确定微生物腐蚀过程的工具。

微生物学 培养基方法 酸处理 分子技术 定量聚合酶链反应 变性梯度凝胶电泳

1 总述

1.1 传统方法与新方法的对比

尽管培养基和计算方法已经有了很大的发展,但现在普遍接受的只有1%～10%的活跃微生物是这些传统方法培育的,因此要寻找可以应用到大部分微生物,或整个微生物种群的方法。

有几种方法可以检测整个微生物种群,而不用考虑培养的限制。另外,独立培养技术的结果可以更快得到 (几个小时到几天),而传统培养基技术的结果多达30天才可获得),因此需刺激产生快速反应时间,如滥用生物杀虫剂或其他化学剂。

编译:梁双庆 (大庆石油学院)审校:王洋 (大庆石油学院)

1.2 独立培养技术

独立培养技术用于微生物鉴别和量化以及微生物功能的确定 (图1)。

图1 分子方法基于对微生物基因物质的检测 (如DNA和RNA)

1.2.1 直接细胞计数 (DAPI)

微生物细胞在稀释的悬浮液中被收集到一个过滤器中,用荧光染料染色。染料与细胞的遗传物质相结合,过量的染料被冲洗掉,直接用落射荧光显微镜来计数。这是一种全面的计数法,并且适用于注入水和产出水。

1.2.2 荧光原位杂交 (FISH)

微生物种群中的遗传物质 (如DNA和RNA)是每个物种所独有的。使用核糖体RNA序列中碱基对中的16S亚基,基因探针可以探测到不同微生物种群或不同物种。在探针上加上荧光染料,可检测附着在特定基因探针上的细胞。通过使用不同的荧光剂,一次可以对不止一组进行染色,并且通过整体染色 (如DAPI)可获得量化信息。FISH技术是一种成熟的量化活跃微生物的计数法,适用于注入水和产出水,并且可以鉴别特定的微生物种群,如硫酸盐还原原核生物 (SRP)。

1.2.3 定量聚合酶链反应

DNA从样品中提取,这种提取包括存在的所有细胞中的信息。PCR使得特定的DNA目标呈现指数递增,使浓度增加到可以计量的数量 (基因样本大于109)。做调整后PCR可用来定量,称为实时qPCR。在方法中,PCR中有一个信号在每次循环之后都要测量,并与已知浓度的标准曲线相对比,来决定特定微生物种群在这个样本中的最初数量。qPCR的化验分析具有高度敏感性。

1.2.4 变性梯度凝胶电泳 (DGGE)

DGGE描述一个样本中存在的不同微生物种类,因此是一种种群识别方法。含有大量微生物种类的样品在DGGE凝胶上提供相应数量的波带,波带的位置和数量提供足够的信息来比较不同样本中的微生物种群。

当必须对微生物种群进行总体概述时,这种方法经常用于其他处理能力更好的方法之前,如qPCR。

1.2.5 分子技术在油田的应用

分子描述法与培养基技术相比,提供的信息得到了改善。表1简述了分子描述技术的优缺点。分子方法来研究沉淀引起腐蚀的工作证明了一个分化的微生物群,提出微生物引起的腐蚀是由很多种类引起的,而不是过去所预测的。使用分子方法来检验微生物种群对腐蚀程度的影响的研究在例2中描述。

2 实例1

表1 各种分子技术的优缺点

1.2.6 储层酸化

在储层和生产设备中最小化硫化物的生产可以通过向注入水中加入硝酸盐来实现。加入硝酸盐的目的是促进硝化细菌 (NUB)的生长来抑制SRP。

NUB和SRP二者间的转变可以依靠传统的培养基方法进行检测,以在生长介质中不断地稀释和培育为基础。减少硫酸盐的微生物并没有因为注入硝酸盐而被杀死,对于SRP活性的抑制可能无法用传统的计数方法来表示。一些SRP有能力转变为低硝酸盐,并且可以在SRP和NUB的生长介质中生长。例1深入地描述了硝酸盐的注入。

1.2.7 化学处理的影响

目前的研究表明,确定生物杀虫剂的剂量对于对特定生长介质有反应的部分微生物群的影响可能是不合适的。特别是如果微生物对生物杀虫剂产生了抗药性,培养基法的数据可能严重低于其正常活动的估计值。同样,加入其他的化学药剂 (如硫化氢吸附剂、除垢剂和破乳剂)可能会降低微生物的活性,如果监测方法不测定整个微生物种群的数量,这种影响可能永远不会发现。

1.2.8 微生物腐蚀

微生物工艺产生的硫化物一般可以加速腐蚀速率。最近,微生物腐蚀被认为仅限制SRP的活性,尽管用营养基方法对腐蚀产物进行分析来监测SRP,也几乎无法给出有意义的数据。最近,应用

2.1 使用分子工具来监测硝酸盐诱导微生物种群

已经证实,持续注入含有硝酸盐的海水对于控制储层中硫化物生成是有效的。为了避免油层酸化,从2001年1月开始,注入水中添加了硝酸盐。4口井发生了海水突破,并且已经检测到硝酸盐突破,产出水中SRP转变成NUB,证实了硝酸盐的影响。需要健全的监测技术来监测和优化持续的硝酸盐处理。

2.2 Halfdan油田注水系统

2003—2004年对 Halfdan油田注水系统的微生物研究表明,鉴别和量化细菌分子方法优于培养基法。分子技术用于Halfdan油田海水注入管线的清蜡残渣样本上,成功地鉴别和量化了主要微生物种群。使用DAPI和FISH方法确定微生物群的总数。下面是具体使用的FISH探针 (第一代FISH探针)。

◇EUB338(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ)(细菌)

◇ALF968(α-变形菌纲)

◇BET42a(β-变形菌纲)

◇GAM42a(γ-变形菌纲)

◇SRB385(δ-变形菌纲)

◇SRB385Db(δ-变形菌纲中的去硫细菌)

种系发育基因探针SRB385和SRB385Db的目标是一些变形菌纲,即最普遍的SRP生物群。另一方面,NUB不会被一个或者一些基因探针检测到,因为这种生理学特性分布在很多细菌种族之间,包括α-变形菌纲、β-变形菌纲和γ-变形菌纲,它们同样包含不可以利用硝酸盐的成员。

结果如下:

◇FISH方法比起最大或然数 (MPN)法得到的数要准确100倍。

◇活跃的微生物占总微生物计数的55%～66%。

◇FISH法测定δ-变形杆菌纲的数目占所有存在活跃微生物的7%～14%。这类微生物在很多环境中一般是丰富的SRP。MPN技术和最优化培养基结合结果表明没有SRP存在。

◇β-变形菌纲占微生物中的一大部分,用EUB338(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ)探针检测,占所有活跃微生物的50%以上。δ-变形杆菌纲根本不存在,只有很少量的γ-变形杆菌纲存在。很可能β-变形菌纲中的一个未知部分是NUB。因此,最大比例的NUB是50%。

◇分子技术与需要30天繁殖时间的传统MPN技术相比时间更短 (一般是在几天之内)。

Halfdan油田注入水的回流水中无硫化氢。但是,回流水表明存在占优势的SRP菌株,也可以将硝酸盐作为最终电子接收器。菌株脱硫弧菌优先应用硝酸盐,甚至在高硫酸盐浓度存在的条件下,如海水。因此,可能小的生命力强的SRP占 Halfdan油田清管残骸中活性微生物种群的7%～14%,能够从硫酸盐转化为低硝酸盐。

2.3 Halfdan油田生产系统

2005年对 Halfdan 4口生产井中选出的水样进行了分子技术分析,生产井局部海水突破。局部海水突破发生在2002年,Halfdan生产井 HDA-03XA和HDA-07,因为在这2口生产井和注水井HDA-12之间有流通路径,海水突破后,在HDA-03XA和HDA-072口井中检测出硝酸盐和亚硝酸。另外,注水井 HDA-12和生产井HDA-03XA之间通过 HDA-07井存在间接流通路径。

微生物群的鉴别是使用FISH完成的,使用与Halfdan海水注入系统微生物研究中相同的探针。FISH探针同样适用于古生细菌。

在HDA-07产出水中测得,标准的硝酸盐和亚硝酸盐的浓度分别为12 mg/L和9 mg/L,HDA-03XA产出水中为0.6 mg/L和0.3 mg/L。这些结果表明硝酸盐和亚硝酸盐在2口井直接连通路径中被耗尽。

活跃细胞百分率 [应用细菌探针EUB338(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ)FISH法占DAPI法总细菌数的比例],在HDA-07和HDA-03XA这2口井中分别是20%和67%。表明在 HDA-07井中有高浓度的非活跃细胞 (包括死的)。在 HDA-03XA井中,低浓度的硝酸盐和亚硝酸盐与样品中具有更多活跃细胞是一致的,更多的氮化合物被消耗。在 HDA-07井中,亚硝酸盐浓度过高,使得大部分的细胞不活跃。

在HDA-07井中,δ-变形杆菌纲 (SRP)占全部细菌的2%(DAPI法测0.4%),HDA-03X井中为10%(DAPI法测4.7%)。在 HDA-03X中,更高浓度的δ-变形杆菌纲与其高硫化氢产量(25 kg/d)是一致的,HDA-07井的硫化氢产量为4 kg/d。因此,使用 FISH法,δ-变形杆菌纲探针确定的SRP数与2口井中硫化氢的产量有很好的一致性,结果如表2所示。

表2 ____H_D__A_-_07与HDA-03XA井的检测数据

当各种种类的具体探针被用来鉴别主要的微生物群时,发现2口井中占大多数是γ-变形杆菌纲和β 变形杆菌纲。随着硝酸盐和亚硝酸盐在HDA-07与HDA-03XA 2口井之间直接流通通道中的消耗,β-变形杆菌纲在产出水中的比例上升,这表明在储层中部分β-变形杆菌纲被亚硝酸盐抑制,并随着硝酸盐的消耗而复活。

Halfdan产出水中 (海水突破)微生物组成与Halfdan注入海水有显著的不同,因为注入水中存在非常少的γ-变形杆菌纲,产出水中高浓度的微生物表明微生物在储层中繁殖。海洋体系中,使用有机物基质如醋酸盐、丙酸盐和丁酸盐可以使γ-变形杆菌纲相对于其他生长慢的微生物更有竞争力,因为γ-变形杆菌纲对有用营养物质快速反应。

结果证明了分子方法可以用来监测注入水和采出水中微生物种群。当这些微生物种群被归于特定的表现型态 (如硫酸盐的减少)时,这些结果可以用来评价反微生物工艺的有效性。使用这些方法对关键微生物种群进行检测,达到优化化学剂加入的目的,如硝酸盐和生物杀虫剂,以微生物负荷为基础。这些目标检测对于石油工业具有很大的作用,可与目前的营养基检测技术相比。

3 实例2

3.1 使用微生物指纹鉴别法确定水垢样本最可能的腐蚀过程

最近对 Halfdan和Dan 2个油田腐蚀水垢的研究,为分子技术在固体腐蚀水垢中的应用提供了便利。克服早期从原油组分和固体物质中分离细胞和提取DNA的困难,将原油生产中微生物方面的分析提升到了一个新的高度。

3.2 鉴别水垢中的细菌和古生细菌

对Dan油田和 Halfdan油田中水垢的研究表明,使用分子技术对微生物水垢分析是可行的。很多技术已经在应用中:PCR放大技术、凝胶上相对数量基因样本的比较、DGGE和基因排序。半定量的PCR分析表明,与采出水样本相比,水垢沉积物包含高浓度的SRP。

DGGE结果表明,大部分的水垢包含了SRP和产甲烷菌,这些是微生物腐蚀的潜在因素。

下面描述了微生物种群和微生物菌株的鉴别。

3.2.1 SRP

三大类的δ-变形杆菌已经确定:脱硫单胞菌属、脱硫八叠球菌属、脱硫弧菌属。脱硫单胞菌属是脱硫原核生物,使用醋酸作为电子供体,它们不具有减少硫酸盐的能力。脱硫八叠球菌属属于δ-变形杆菌纲的脱硫菌属,已经从油田中分离出来。脱硫弧菌属会引起生物腐蚀,在石油工业中已引起大量的健康和安全问题,研究的目标是更好地理解脱硫弧菌属和它作为电子接受体在硝酸盐和硫酸盐之间的转变能力。

3.2.2 梭状芽胞杆菌

已经鉴别出一定量的梭状芽胞杆菌会发酵出碳水化合物,生产出酪酸;一些能够固定氮,其他的可以发酵出氨基酸。不同的梭状芽胞杆菌已经从储层中分离出来:乙二醇梭菌 (油厂污染水的酸代谢菌株)、互营单胞菌属 (从海洋生产井分离出来的硫酸盐还原菌)、脱硫肠状菌属 (从热油储层中分离出来的硫嗜热硫酸盐还原菌)和韦荣氏菌科。

3.2.3 热袍菌目

一种变化很少的细菌分支,热袍菌属生长温度相对适中,而该目其他的成员都是生长在最优温度60～90℃的超嗜热菌。它们使用硫而不是氧作为电子接受体,在新陈代谢中,产生硫化氢。热袍菌目是厌氧的,但是可以忍耐一定程度的氧。

3.2.4 甲烷八叠球菌目 (古细菌)

甲烷八叠球菌目是厌氧产甲烷菌,可以形成多细胞的菌落。

3.2.5 产甲烷细菌 (古细菌)

古细菌成员都使用有限分解代谢的基质,它们一般是嗜氢的,使用 H2来减少CO2使其变成甲烷。一些成员可以用甲酸盐、CO或者乙醇作为电子供体来减少CO2。另一些成员,甲烷球形菌属使用H2来将甲醇变成甲烷。

3.2.6 球菌目 (甲烷热球菌属)(古细菌)

主要有两个种类。它们在一定矿物中利用 H2、CO2和甲酸盐作为甲烷热球菌属的电子供体进行自氧生活。醋酸盐、甲醇和甲胺不能作甲烷产物的基质。有机碳源不会促进生长。

3.2.7 微生物影响腐蚀进程

在一些例子中,生态或者非生态的产氢可能是产甲烷菌的重要能源,与一定数量的SRP一起在油田环境下生长。醋酸盐在北海油层中累积浓度达到20 mM,这可能是一种重要的能源,可以直接或者间接被甲烷热球菌利用。

基于以上观察,微生物活动对腐蚀的影响很可能是整体作用的结果。

4 展望

分子方法为石油体系样本中各种微生物种群的鉴别和量化提供了一个窗口。这些方法在传统营养基方法基础上有了很大的改进,因为传统的营养基法适用的微生物物种十分有限。有用数据数量及其复杂性水平随着基因方法的使用得到提高。数据解释和描述微生物生态学和相互作用的模型也成为研究的重要部分。

4.1 微生物作为活的生物传感器

在石油生产中,这种方法把合适的微生物转变为有用的环境生物传感器。微生物系统对改变作出反应如季节变化,或者人工操作如生物杀虫剂处理。给定的细菌在给定的环境会繁殖或退化,这取决于它与微生物群中其他成员之间的竞争。微生物可以被看作活的生物感应器,分子检测技术可以看作是从生物传感器和体系中读取数据的方法。

4.2 新方法——范例

对给定体系设计一个相应的微生物检测:

(1)评价研究体系中整个微生物群。

(2)评价生态平衡和工艺对复杂微生物的影响。

(3)设计相关引物结合到智能诊断工具中。

在石油工业,这些新方法的应用已经得到证实:

◇检测和控制微生物提高原油采收率工艺,检测地层中生物表面活性剂产生的微生物;

◇评价硝酸盐处理方法,由具体种类的SRP或者硝酸盐是否会影响硫化氢的生产来确定投入硝酸盐的剂量;

◇选择和优化微生物杀虫剂的方法;

◇评价微生物腐蚀和减缓微生物腐蚀;

◇基于SRP的微生物突破预测储层酸化;

◇基于大量水的监测预测地面微生物工艺。

10.3969/j.issn.1002641X.2010.4.001

资料来源于美国《SPE Production&Operations》2009年2月

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