注射用复方甘草酸苷细菌内毒素检查方法的研究

马建丽，朴晋华，陈新文，周 亮 (解放军总医院第一附属医院药剂药理科，北京 00048;山西省药品检验所)

注射用复方甘草酸苷是由甘草酸苷、甘氨酸和盐酸半胱氨酸组成的复方制剂，具有调节免疫、抑制病毒增殖及灭活病毒、降低转氨酶和改善肝组织损伤等作用。该药具有较强的抗炎、抗变态反应活性及皮质激素样作用，并且取得了良好的疗效。临床用于治疗慢性肝病，改善肝功能异常，亦可用于治疗湿疹、皮肤炎、荨麻疹。为了保证临床用药安全，本文依据中国药典2005年版二部细菌内毒素检查法［1，2］，对应用鲎试剂检测注射用复方甘草酸苷中细菌内毒素的可行性进行了方法学研究，并给出了细菌内毒素限值，为其质量控制提供了实验室依据，该法具有灵敏度高、成本低、操作简便、不需要特殊仪器等优点，便于药品生产流通各个环节的监控。

1 材料

1.1 试药 鲎试剂(TAL)有2种:①湛江博康海洋生物有限公司，批号0802290，灵敏度为0.25 EU/ml，0.1 ml/支;② 厦门市鲎试剂实验厂，批号090741，灵敏度为0.125 EU/ml，0.1 ml/支。细菌内毒素工作标准品(中国药品生物制品检定所，批号2009－65，180 EU/支);细菌内毒素检查用水(中国药品生物制品检定所，批号W2008-4，10 ml/支);注射用复方甘草酸苷(四环药业股份有限公司，批号:200905262、200905312、200907182，规格为 80 mg/支)。

1.2 仪器 电热恒温水浴箱，北京市医疗设备厂，型号:GSY-Ⅱ;漩涡混合器，上海环球物化仪器厂，型号:WH-861。

2 方法

2.1 内毒素限值(L)的确定 按细菌内毒素检查限值公式L=K/M，其中K为按规定的给药途径下，人用每千克重每小时最大可接受的内毒素剂量，注射剂量为5.0 EU/(kg·h)，M为人用每小时每千克重的最大剂量。本品成人通常1次/d，80－120 mg静脉注射或静脉滴注，可依年龄、症状适当增减，增量时用药剂量限度为200 mg/d。按临床剂量一次200 mg 甘草酸苷计算，L=K/M=5.0 EU/(kg·h)/200 mg/(60 kg·h)=1.5 EU/mg。

2.2 鲎试剂灵敏度复核 按中国药典2005年版二部细菌内毒素检查法进行试验，所用鲎试剂灵敏度均在0.5λ－2.0λ范围内时，符合规定，可用于本试验。

2.3 最小有效稀释浓度(MVC)的计算 按公式MVC=λ/L计算，其中L为本品的细菌内毒素限值;λ为鲎试剂标示灵敏度，目前市售鲎试剂灵敏度λ通常在0.5－0.03 EU/ml，则本品对应的有效稀释浓度为:0.33－0.02 mg/ml。

2.4 干扰预试验 将供试品用细菌内毒素检查用水稀释成 2，1，0.5，0.25，0.12，0.06，0.03 mg/ml的供试品溶液，将此系列浓度溶液记为供试品溶液组(NPC)，另配制两组同系列浓度的供试液，使其中一组每一浓度的供试液中均含有2λ浓度的细菌内毒素，记此系列溶液为供试品1(PPC1)，另一组含有0.25 λ浓度的细菌内毒素，记为供试品2(PPC2)。取灵敏度为0.25 EU/ml和0.125 EU/ml两个不同厂家的鲎试剂，分别与上述PPC1、PPC2、NPC进行反应，每一浓度重复两管，并设阳性对照记为PC和阴性对照记为NC。

2.5 供试品干扰试验 取3批注射用复方甘草酸苷，用BET水分别稀释至0.25 mg/ml，用该浓度溶液和BET水分别将内毒素标准品制成0.5，0.25，0.125，0.062 5，0.03 EU/ml的一系列浓度，与两个厂家灵敏度分别为 0.25 EU/ml、0.125 EU/ml的鲎试剂反应，每一浓度做4管，同时作阴性对照，37℃孵育60 min后观察结果，当内毒素标准溶液的反应终点(Es)值在0.5λ－2.0λ(包括0.5λ 和2.0λ)时，而供试品溶液的反应终点浓度(Et)值在0.5－2.0Es(包括0.5Es和 2.0Es)时，即无干扰作用，反之，则有。

2.6 供试品限量检查试验 根据干扰试验结果，本品采用上述制定的限值进行细菌内毒素检查。分别选用两个不同厂家生产的鲎试剂，按照中国药典2005年版附录ⅪE进行供试品的细菌内毒素检查。

3 结果

3.1 鲎试剂灵敏度复核 两批鲎试剂经用细菌内毒素工作标准品检查λc与λ一致，均符合规定，结果见表1。

3.2 供试品干扰预试验 预试验结果显示注射用复方甘草酸苷在0.5 mg/ml及其以下浓度时对鲎试剂的凝集反应无干扰作用，结果见表2。

3.3 供试品干扰试验 注射用复方甘草酸苷在0.25 mg/ml浓度时对两个厂家鲎试剂的凝集反应确无增强或抑制作用，结果见表3。

3.4 供试品限量检查试验 用两个厂家的鲎试剂对本品连续3个批号进行了内毒素限量检查，结果均符合规定，结果见表4。

表1 鲎试剂灵敏度复核Tab 1 Confirmation of labeled TAL reagent sensitivity

表2 干扰预试验结果Tab 2 Results of interference pretest

表3 干扰试验结果Tab 3 Results of interference test

表4 细菌内毒素限量检查结果Tab 4 Results of bacterial endotoxin limit test

4 讨论

4.1 复方甘草酸苷可以抑制TAL细菌内毒素的凝集反应，但通过稀释可消除干扰。由干扰预试验可知，将粉针剂稀释至0.5 mg/ml及以下浓度时，对细菌内毒素与鲎试剂反应无干扰作用，且两个厂家生产的鲎试剂反应结果一致。

4.2 正式干扰试验用灵敏度为 0.25 EU/ml、0.125 EU/ml两个厂家的 TAL，对3批稀释浓度为0.25 mg/ml注射用复方甘草酸苷进行细菌内毒素检查的干扰试验，结果本品对细菌内毒素与TAL的反应无干扰作用。

4.3 试验结果证明，注射用复方甘草酸苷细菌内毒素限值确定为1.5 EU/mg，据此建立的细菌内毒素检查法可行，且方便快捷，结果准确。

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)［M］.北京:化学工业出版社，2005:附录85.

［2］ 中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规程［M］.北京:医药科技出版社，2005:287.