介孔分子筛SBA-16固定化木瓜蛋白酶性质的研究*

孙伟杰，王素艳，谷桂娜，刘春艳

（辽宁师范大学化学化工学院，辽宁大连116029）

介孔分子筛SBA-16固定化木瓜蛋白酶性质的研究*

孙伟杰，王素艳，谷桂娜，刘春艳

（辽宁师范大学化学化工学院，辽宁大连116029）

以介孔分子筛SBA-16为载体采用物理吸附的方法对木瓜蛋白酶进行了固定化，研究了固定化条件对酶的相对活性的影响及在不同pH值下游离酶和固载酶的pH稳定性。实验结果表明当1 g载体的給酶量为30 mg，固定化时间为2.5 h，pH值为7.0时，固定化木瓜蛋白酶的相对活性最好。与游离酶相比，固定化酶的pH稳定性有明显改善。

SBA-16分子筛；固定化；木瓜蛋白酶；相对活性

木瓜蛋白酶是一种蛋白水解酶，因其作用温和、特异性强，在食品、医药等工业领域中应用广泛[1-2]。然而游离的木瓜蛋白酶pH稳定性差，在溶液中易发生自解，因此使用效率很低。与游离酶相比，固定化酶具有很好的pH稳定性，正逐步受到国内外研究人士的重视。例如，北京化工大学的肖宁等[3]采用戊二醛作为交联剂，MCM-41为载体固载木瓜蛋白酶；北京化工大学赵炳超等[4]以MCM-48为载体，戊二醛作交联剂对木瓜蛋白酶进行了固定化研究等均已见报道。他们采用的固载方法为共价交联法，该方法的优点是酶与载体之间的连接很牢固，稳定性好，但反应条件激烈，操作复杂，得到的固定化酶的活性较低。物理吸附的方法操作简单，反应条件温和，载体可反复使用[5]，有利于保持酶分子的结构和性能，从而有效克服了交联法对酶性能的干扰。这方面的研究在国外已经开始，例如，Diaz等[6]曾经采用MCM-41作为载体，进行了直接吸附木瓜蛋白酶的研究，并取得了一定效果。

1 实验部分

1.1 实验材料

SBA-16分子筛（实验室自制）、木瓜蛋白酶（Sigma公司）、酪蛋白（Sigma公司）、酪氨酸（Sigma公司）；盐酸半胱氨酸、EDTA、三氯醋酸以及配制缓冲溶液（0.1 mol/L的钠盐）所用的磷酸盐等，均为分析纯。

1.2 固定化木瓜蛋白酶的制备

将1 g的SBA-16粉末和3 mL，pH为7.0的磷酸缓冲溶液加入25 mL的锥形瓶内，然后再加入5 mg/mL的木瓜蛋白酶溶液1 mL。固定化反应在温度为20℃，搅拌速度为180 r/min的条件下进行2 h，过滤，洗涤，自然干燥，即得到固定化木瓜蛋白酶。

1.3 游离及固定化木瓜蛋白酶活性的测定[7]

木瓜蛋白酶的活性是以酪蛋白作底物、酪氨酸作标准物用紫外方法测量。具体操作如下：精密量取酪蛋白溶液3 mL，加入5 mg/mL的木瓜蛋白酶溶液1 mL和2 mL的激活剂，摇匀，置40℃水浴中，酶解20 min，加入3 mL三氯醋酸溶液终止酶解反应，过滤，滤液稀释20倍作供试液。上述条件，先加三氯醋酸，再加木瓜蛋白酶溶液置40℃水浴中放置20 min，过滤，滤液稀释20倍作空白溶液。以0.1 mol/L盐酸溶液作空白，酪氨酸为对照品，在275 nm波长处测定空白溶液、供试液和对照品溶液的吸光度。

式中：A—供试液的吸光度减去空白溶液的吸光度；

As—酪氨酸对照品溶液的吸光度；

Cs—酪氨酸对照品溶液的质量浓度，μg/mL；

W—样品质量，mg。

相对活性指以同组实验中活性最大值为100%其它实验点值与该点进行比较。

2 结果与讨论

2.1 SBA-16分子筛和固定化木瓜蛋白酶的表征

图1为SBA-16分子筛和固定化酶的XRD图。

2种样品的XRD图均具有SBA-16分子筛典型的特征衍射峰，这与文献[7]报道的纯硅SBA-16图一致。从图1可知固定化酶的XRD图中2θ要比SBA-16分子筛的大，说明酶进入SBA-16分子筛的孔径内，使载体的孔径变小，但并没有破坏SBA-16分子筛的框架结构。

2.2 固定化条件对固定化酶活性的影响

2.2.1 固定化时间的影响

采用不同的固定化时间，制得的固定化酶的相对活性见图2。

从图2可以看出，随着固载时间的增加，固定化酶的相对活性先增加后降低，其原因可能是：（1）随着搅拌时间的延长，进入载体孔道内的酶量增加，固定化酶的相对活性升高；（2）木瓜蛋白酶分子停留在载体孔口，使另一部分酶分子需要克服扩散阻力才能进入到载体的孔道内部，并且已经固定上的酶由于受到载体的影响可能变性失活[3]，使得固定化酶的相对活性开始降低。因此，固定化木瓜蛋白酶的最佳搅拌时间为2.5 h。

2.2.2 给酶量的影响

体积一定，浓度不同的木瓜蛋白酶溶液，在相同的固定化时间2 h内制得的固定化酶的相对活性见图3。

由图可知，当1 g载体的给酶量达到30 mg时，固定化酶的相对活性最高，继续增加给酶量，固定化酶的活性缓慢下降。在搅拌时间一定的条件下，随着给酶浓度的增加，载体对木瓜蛋白酶的吸附逐渐达到最大吸附，固定化酶的相对活性也达到最大值。固载上的酶易脱落或发生变性而使固定化酶的相对活性缓慢下降。

2.2.3 pH对固定化的影响

用相同体积，不同pH值的磷酸缓冲溶液制得的固定化酶的相对活性见图4。

从图4可以看出，固载后的木瓜蛋白酶在pH值为7.0左右相对活性最大，原因可能是：酶在酸碱性的溶液中，极易失活，导致固定化酶的活性降低。

2.3 固定化酶的pH稳定性

取等量游离木瓜蛋白酶及上述最佳条件下制得的固定化木瓜蛋白酶分别放在不同pH值的磷酸缓冲溶液中，静置24 h。得出游离酶及固定化酶的相对活性如图5所示。

从图5可以看出，在pH 5.8～7.8的范围内，固定化酶的pH稳定性范围比游离酶更宽。因为SBA-16表面富含羟基，这些羟基可以对分子筛孔道中溶液的pH值起一定的缓冲作用，从而使孔道内溶液的pH变化范围小于磷酸缓冲溶液的pH变化范围，这很可能是固定化木瓜蛋白酶pH稳定性提高的一个重要的原因[8]。

3 结论

本文采用物理吸附的方法，以SBA-16分子筛做载体固定化木瓜蛋白酶。实验结果表明当1 g的 SBA-16分子筛载体在pH值为7.0的磷酸缓冲溶液中，给酶量为30 mg，固定化时间为2.5 h时，固定化木瓜蛋白酶的相对活性最好。与游离酶相比，固定化酶的pH稳定性有明显提高。因此，SBA-16分子筛可以作为一种固载木瓜蛋白酶新的载体。

[1]赵元藩，丁认全.木瓜蛋白酶的加工工艺及应[J].云南师范大学学报，1999，19（5）：15-17.

[2]乙引，陈平，王茜.木瓜蛋白酶改良啤酒品质的研究[J].贵州农业科学，2000，28（4）：14-16.

[3]肖宁，赵炳超，王艳辉.介孔分子筛MCM-41固定化木瓜蛋白酶的研究[J].北京化工大学学报，2005，32（4）：41-43.

[4]赵炳超，马润宇，石波.介孔分子筛MCM-48固定化木瓜蛋白酶性质的研究[J].食品与发酵工业，2005，31（10）：60-63.

[5]陈静.介孔材料固定酶的性质和稳定性研究[D].长春：吉林大学，2005.

[6]Felipe J，Diaz，kenneth J，et al.Enzyme immobilized in MCM-41 molecular sieve[J].Journal of Molecular Catalysis B，Enzymatic，1996（2）：115-126.

[7]罗远秀.木瓜酶活力测定方法的研究[J].广西药品检验所，2000，35（8）：556-558.

[8]赵丽芳.脂肪酶的固定化及其催化性能的研究[D].长春：吉林大学，2008.

Immobilization of Papain on Mesoporous Molecular Sieve SBA-16

SUN Wei-jie，WANG Su-yan，GU Gui-na，LIU Chun-yan

（College of Chemistry and Chemical Engineering，Liaoning Normal University，Liaoning Dalian 116029，China）

Papain was immobilized on the mesoporous molecular sieve SBA-16 by physical adsorption method.The effects of immobilization conditions on the relative activity of the papain were studied.At the same time，the pH stability of the free enzyme and immobilized enzyme was discussed at different pH values.Experimental results show that the optimum conditions for immobilization are as follows:concentration of the free enzyme，time，and pH are 30 mg/g，2.5 h and 7.0，respectively.Compared with the free enzyme，pH-stability of immobilized papain has also been improved.

Molecular sieve SBA-16；Immobilized；Papain；Relative activity

TQ925+.2

A

1671-0460（2010）02-0129-03

2010-03-03

孙伟杰（1983-），女，硕士研究生。

刘春艳（1971-），女，副教授，研究方向为介孔材料的制备与应用。E-mail:lcybeauty@163.com。