大孔树脂纯化金褐霉素的研究

孟宪军,王 琼,＊,魏 杰

(1.沈阳农业大学食品学院,辽宁沈阳 110161;2.辽宁大学生命科学院,辽宁沈阳 110036)

大孔树脂纯化金褐霉素的研究

孟宪军1,王 琼1,＊,魏 杰2

(1.沈阳农业大学食品学院,辽宁沈阳 110161;2.辽宁大学生命科学院,辽宁沈阳 110036)

通过比较八种大孔树脂对金褐霉素发酵液的吸附和解吸效果,从中筛选出适合金褐霉素分离纯化的树脂,并对其吸附和解吸性能进行研究。结果表明,X-5树脂最适合金褐霉素的纯化,洗脱剂甲醇的体积分数为 80%,上样液pH5.0,洗脱液 pH7.0,吸附流速为 1.0BV/h,洗脱流速为1mL/min,此方法所得金褐霉素纯度较高,且有明显的脱色效果。

大孔吸附树脂,金褐霉素,纯化,HPLC法

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

金褐霉素提取液 本实验室自制;甲醇 分析纯,沈阳化学试剂厂;X-5大孔吸附树脂 天津南开大学化工厂;HPD100、HPD400、HPD600、HPD200A、AB-8大孔吸附树脂 沧州宝恩化工有限公司;D101大孔吸附树脂 上海迈坤化工有限公司;WD-6大孔阴树脂 安徽皖东化工有限公司。

SBA-100数控计滴自动部分收集器、HL-2S恒流泵 上海青浦沪西仪器厂;玻璃层析柱 Ф1cm× 30cm 华美实验仪器厂;RE-52型旋转蒸发仪 上海博通经贸有限公司;SH2-D(Ⅲ)循环水式真空泵巩义市英峪予华仪器厂;高效液相色谱仪 美国Waters;FA1104电子天平 上海天平仪器厂; pHS-25型酸度计 上海理达仪器厂;DZF-6050型真空干燥箱 上海精宏仪器设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵液预处理 取发酵液加入离心管,充分振荡后高速离心 (10000r/min,10min)所得上清液即为待测液。

1.2.2 树脂预处理 树脂采用常规方法进行预处理,预处理流程如下：以 0.5BV(1BV为 1个树脂床体积)的乙醇浸泡树脂 24h;用 2BV乙醇以 2BV/h的流速通过树脂柱,并浸泡树脂 4～5h;用乙醇 2BV/h的流速洗涤树脂,至流出液加水不呈白色混浊为止,再用水以同样流速洗净乙醇;用 2BV的 5%HCl溶液以4～6BV/h的流速通过树脂层,并浸泡树脂 2～4h,而后用水以同样流速洗至出水 pH呈中性;用 2BV的2%NaOH溶液以 4～6BV/h的流速通过树脂层,并浸泡树脂 2～4h,而后用水以同样流速洗至出水 pH呈中性[8]。

1.2.3 大孔树脂静态吸附率及解析率测定 准确称取已预处理的大孔树脂 1.00g,置于 100mL具塞三角瓶中,加入 20mL金褐霉素提取液,置于室温振荡吸附 24h后,测定金褐霉素提取液的浓度。用蒸馏水洗去溶液中残余金褐霉素后吸干水分,然后用甲醇洗脱树脂,分别测定洗脱液中金褐霉素的浓度,计算各树脂的吸附率及解析率。

吸附率Q(%)=(C0-C1)×100%/C0

式中：Q-吸附率(%);C0-吸附前浓度,mg/mL; C1-吸附后浓度,mg/mL。

解吸率D(%)=C2×100%/(C0-C1)

式中：D-解吸率(%);C0-吸附前浓度,mg/mL; C1-吸附后浓度,mg/mL;C2-解吸后浓度,mg/mL。

1.2.4 上样液最适 pH的选择 将金褐霉素提取液用NaOH或 HCl溶液调至不同的 pH,上柱,依次用200mL同样 pH的蒸馏水及甲醇进行洗脱,收集甲醇洗脱液,测定金褐霉素的浓度,确定其最佳 pH。

1.2.5 洗脱液最适 pH的选择 取一定量的金褐霉素提取液上柱,先用蒸馏水洗脱至无色后,依次用200mL不同 pH的甲醇进行洗脱,收集不同 pH的甲醇洗脱液,测定其金褐霉素的浓度,以确定最佳的洗脱剂pH。

1.2.6 洗脱剂浓度的选择 取一定量的金褐霉素提取液上柱,先用蒸馏水洗脱至无色后,依次用 200mL 20%～100%浓度的甲醇溶液进行洗脱,收集不同浓度的甲醇洗脱液,测定金褐霉素的浓度,以确定最佳的洗脱剂浓度。

1.2.7 大孔树脂动态吸附与解析实验 树脂湿法装柱(1.0cm×30.0cm),分别以 0.5、1.0、1.5BV/h的流速加入一定体积浓度的金褐霉素的供试液,待样品溶液全部通过树脂柱后,分步收集流出液 (每管25mL),定时检测流出液中金褐霉素的浓度,当达到泄漏浓度时,视为吸附完全,确定最佳吸附流速。

取一定体积浓度的金褐霉素供试液上柱,待吸附饱和后,用 2BV的蒸馏水洗涤后,再用甲醇分别以0.5、1.0、1.5mL/min的流速进行洗脱,分段收集洗脱液(每管 25mL),测其金褐霉素含量,确定其最佳洗脱流速。

1.2.8 金褐霉素测定 采用高效液相色谱法测定[9]。

2 结果与分析

2.1 大孔吸附树脂对金褐霉素的静态吸附与解析效果比较

物质在溶剂中的溶解度大,树脂对此物质的吸附力就小,反之就大。吸附实验前将金褐霉素提取液进行减压浓缩,在温度 25℃,转速 100r/min的条件下进行吸附和解吸,再用 100%甲醇进行洗脱,吸附和解吸时间均为 24h,8种大孔吸附树脂筛选结果显示如表1。

表 1 大孔树脂对金褐霉素的静态吸附与解析性能

从表 1中可以看出,HPD400,X-5,WD-6,AB-8四种树脂的吸附率较高,均可达到 70%以上,X-5达78.7%。在生产上不仅要求树脂吸附率大,还要求解吸率高,以保证有效成分最大限度回收。因此,解吸率也是树脂实验考察的重要指标。由表 1可知, HPD100树脂和X-5树脂的解吸率较好,综合吸附率和解吸率两个指标,因而选定 X-5型树脂作为较适宜的填料进行后续实验研究。

2.2 上样液 pH对 X-5树脂吸附性能的影响

在溶液介质中,金褐霉素的结构会随 pH的降低或升高而发生降解。金褐霉素在 pH4～8的范围内较稳定,因此,将 pH的考察范围设定为 4、5、6、7、8进行实验。由图 1可知,上样液 pH为 5时,树脂对金褐霉素的吸附率最高,上样液 pH为 8时次之。而发酵达到终点时的发酵液 pH在 5～6.5范围内,因此,可稍微调整或不用调整发酵液的 pH直接进行吸附。

图 1 上样液pH对树脂吸附金褐霉素的影响

2.3 洗脱液 pH对解吸的影响

洗脱液的 pH对金褐霉素的洗脱能力有影响。通过改变洗脱液的 pH,可使吸附物形成较强的离子化合物,很容易被洗脱下来,从而提高洗脱率。

图 2的实验结果表明,随着 pH逐渐升高,解吸率逐渐升高,在 pH为 7时,X-5树脂对金褐霉素的解吸效果最好,且有明显的脱色效果。但当 pH为 8时,解吸率陡然下降,说明洗脱液的 pH对解吸率的影响很大。

图 2 洗脱液pH对树脂解吸金褐霉素的影响

2.4 洗脱剂浓度的确定

将已吸附金褐霉素饱和的 X-5树脂等分成 9份,分别用不同浓度的甲醇溶液作为解析剂,测定解析液的金褐霉素含量,计算解析率。图 3的实验结果表明,随着甲醇浓度的逐渐升高,解吸率逐渐升高,在甲醇浓度达到 100%时,解吸率达到最高。甲醇浓度在 80%～100%之间,解吸率相差不是很大。考虑到节约成本,可以选用 80%甲醇作为洗脱剂。

图 3 洗脱剂浓度对树脂解吸金褐霉素的影响

2.5 上样液流速对树脂吸附的影响

流出液中的目的产物浓度达到进口浓度的 10%时,即为吸附终点。达到吸附终点时上样液的体积值就是泄露点。从图 4可以看出,流速越大,层析柱的泄漏点越提前,X-5树脂的吸附效果随着流速的增加而降低。这是因为大孔吸附树脂的柱层析是多分子层吸附,是一种动态吸附过程。流速对吸附的影响主要是影响溶质向树脂内表面扩散,从而影响了吸附效率。流速过快,接触时间短,金褐霉素还没来得及与树脂内表面接触就流出吸附柱,极大降低吸附效果。虽然低流速对吸附有利,但流速过低,操作时间长,效率较低。当流速为 0.5BV/h和 1.0BV/h时的泄露点出现的时间接近,所以从提高效率考虑,选择 1.0BV/h为最佳上柱流速。

图 4 吸附流速对金褐霉素吸附效果的影响

2.6 洗脱流速的确定

一般情况下,洗脱流速过大,洗脱溶剂还没来得及交换和溶解大孔吸附树脂上被吸附的有效成分,就从柱中流出,从而没有达到分离纯化的目的,而且也极其耗费溶剂;但洗脱流速过小,洗脱时间就会增加。在实际应用中,应综合考虑,选用合适洗脱流速,既要使大孔吸附树脂的洗脱效果好,又要保证较高的工作效率[10]。实验用甲醇溶剂以不同的洗脱流速对饱和吸附的树脂进行洗脱,分析结果见图 5。

图 5 洗脱流速对金褐霉素洗脱效果的影响

从图 5中可以看出,流速对洗脱效果有明显影响,流速越高,洗脱时脱尾现象越明显,所需洗脱剂也就越多。以 0.5mL/min和 1.0mL/min流速洗脱金褐霉素,峰形陡峭,峰值较高,综合考虑实验效率,控制洗脱流速在 1.0mL/min为佳,此时既能达到满意效果,又能提高洗脱效率。

3 结论

金褐霉素可以通过用大孔吸附树脂进行分离纯化。通过对八种树脂吸附性能对比筛选,认为 X-5树脂最适合金褐霉素的纯化。实验结果表明,洗脱剂体积分数为 80%,上样液 pH5.0,洗脱液 pH7.0,吸附流速为 1.0BV/h,洗脱流速为 1mL/min时,此方法所得金褐霉素纯度较高,且有明显的脱色效果。

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Study on the purification of aureofuscin by macroporous resin

M ENG Xian-jun1,WANG Qiong1,＊,W EI Jie2
(1.Food SciencesAcademy,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang 110161,China; 2.Life and SciencesAcademy,LiaoningUniversity,Shenyang 110036,China)

Through the comp a rison am ong the e ight typ es of m ac rop orous res in adsorp tion and desorp tion ra te of aureofusc in,the op tiona l m ac rop orous res in for aureofusc in was dec ided,and absorp tion and desorp tion cap ab ilities of aureofusc in we re s tud ied.The results showed tha t X-5res in was the bes t one for the p urifica tion of aureofusc in,w ith80%m e thanol as e luant.Samp le pH was5.0,and flowed pH was7.0.The m oving sp eed was 1.0BV/h and the e luting sp eed was1.0mL/m in.Then,highe r p roduc t p urity and c lea r effec t on decolored can be ob ta ined.

m ac rop orous res in;aureofusc in;p urifica tion;HPLC m e thod

TS201.1

B

1002-0306(2010)02-0277-03

金褐霉素 (Aureofuscin)是链霉菌新种—金褐链霉菌 (Streptomyces aureofuscus.n.sp)产生的一种四烯大环内酯类抗真菌抗生素,其化学结构与国外文献报道的纳他霉素(Natamycin)结构相似。早期研究表明,金褐霉素对霉菌、多种酵母菌及丝状真菌有很强的抗菌作用,但不抗细菌,临床上用于治疗真菌性角膜炎,其疗效优于两性霉素 B,同时对一些真菌引起的皮肤病及霉菌性阴道炎等也有很好疗效。金褐霉素早在 1975年发现时只作了早期化学结构和初步药效实验后,一直未作深入研究和进行产业化开发[1-3]。迄今为止,国内真正拥有自主知识产权的四烯类抗生素只有金褐霉素。在 1997年我国正式批准使用纳他霉素作为安全食品防腐剂后,金褐霉素才被重新重视起来,由于未作高产菌种选育和分离提取工艺的深入研究,发酵单位和提取收率都不高,难以达到产业化开发要求[4-6]。鉴于金褐霉素与纳他霉素有着相似的化学结构和生物活性,而纳他霉素现在主要依赖进口,因此,金褐霉素的研究开发在真菌疾病的防治和食品防腐上显示出了极好的应用前景和市场潜力,这对促进新药研制、食品防腐和发酵工业的发展都具有积极意义。目前关于金褐霉素分离提取方面的研究鲜有报道。大孔吸附树脂是近十年来发展起来的一类有机高分子聚合物吸附剂,广泛用于生物活性物质的分离提取[7]。本研究采用 8种不同类型大孔吸附树脂对发酵液进行吸附和解吸,从中筛选出适合金褐霉素分离纯化的树脂,并对其吸附和解吸性能进行研究,优化大孔树脂分离纯化金褐霉素的工艺,为金褐霉素的大规模生产奠定基础。

2009-04-17 ＊通讯联系人

孟宪军(1960-),男,教授,沈阳农业大学食品学院院长,研究方向：食品制造与保藏。