抗氧化大豆多肽制备的研究

周婷婷,李 燕,宋 斐

(上海海洋大学食品学院,上海 201306)

抗氧化大豆多肽制备的研究

周婷婷,李 燕,宋 斐

(上海海洋大学食品学院,上海 201306)

以还原能力、清除超氧阴离子自由基和过氧化氢能力为指标,筛选制备抗氧化大豆多肽的水解酶及水解条件,得到高效的抗氧化大豆多肽制品。结果表明：选择 1000U/g菠萝蛋白酶、2000U/g中性蛋白酶、2000U/g碱性蛋白酶,三酶复合在 pH6.0,酶解温度 50℃,底物浓度 8.0%的酶解条件下,对大豆蛋白酶解 4h,多肽的抗氧化能力表现最强,还原能力达到 0.898,超氧阴离子自由基的清除率达到 40.93%,过氧化氢的清除率达到 33.37%。经超滤分离,分子量小于 10KDa而大于 5KDa的多肽表现出较强的还原能力,而小于 5KDa的多肽表现出较强的清除超氧阴离子自由基和过氧化氢的能力。

抗氧化,大豆多肽,酶解,超滤

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

全溶解大豆蛋白粉 河南安阳漫天雪大豆蛋白有限公司,蛋白质含量约为 92.84%;菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶 SIG MA公司;抗超氧阴离子自由基与产生超氧阴离子自由基测试盒、双氧水测试盒 南京建成生物科技研究所。

冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂,G L-20G-II;真空冷冻干燥器 CHR IST ALPHA1-2;超低温冰箱海尔公司;RO-NF-UF-4100型膜分离装置、中空纤维式超滤组件 (外压式 PP-100、PS-5,内压式PS-10) 上海摩速科学器材有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 大豆蛋白水解物的制备[4]称取大豆蛋白溶于缓冲液中,90℃处理 5min,冷却至一定温度后,定容到原体积并调节pH至酶的最适值。置于恒温水浴调节到酶的最适温度,加入蛋白酶启动水解反应。水解结束后,100℃灭酶 10min。冷却后,4℃,5000r/min离心 15min,取上清液冷冻干燥,冷冻保存待用。

1.2.2 酶活力的测定 福林酚法[5]。

1.2.3 水解度的测定 甲醛滴定法[6]。

1.2.4 抗氧化能力的测定

1.2.4.1 样品的还原能力[7]将 10mg样品溶于 1mL蒸馏水中,加入 2.5mL 0.2mol/L PBS(pH6.6)和2.5mL 1%的铁氰化钾溶液,混匀,从上述混匀的混合液中取 1mL,然后加入 0.2mL 0.1%的三氯化铁溶液混匀,再加 1mL蒸馏水摇匀,以蒸馏水调零,在700nm处测定吸光度。吸光度越高,说明样品的还原能力越强。

1.2.4.2 样品的抗超氧阴离子自由基能力 方法参照测试盒说明书。

1.2.4.3 样品清除过氧化氢的能力 方法参照测试盒说明书。

1.2.5 超滤分离 将大豆蛋白酶解物离心,取上清液,经 100kDa超滤膜 (PP-100中空纤维组件)截流分离,保留浓缩液;将滤液再经 10kDa超滤膜(PS-10中空纤维组件)截流分离,保留浓缩液;将滤液再经5kDa超滤膜 (PS-5中空纤维组件)截流分离,保留浓缩液。超滤过程保持组件最大工作压力不超过0.15MPa,依次制备分子量为 100kDa以上、10～100kDa、5～10kDa、5kDa以下的大豆多肽溶液。然后将各部分溶液进行真空冷冻干燥,分别测定各部分的抗氧化活性。

2 结果与讨论

2.1 酶的筛选

目前,用于水解大豆蛋白的水解酶主要有胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、细菌蛋白酶和霉菌蛋白酶等,要制备尽可能多的活性肽类产物,一般不应选用端肽酶[8-9]。不同蛋白酶的专一性不同,酶切位点不同,导致水解产物中多肽也有区别,获取抗氧化大豆多肽的数量、活性就有较大不同,因此蛋白酶的选择尤为重要。

胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶,分别在各种酶的最适 pH和温度下,以相同的酶量对大豆蛋白进行酶解,以酶解物的还原能力、超氧阴离子自由基清除能力、双氧水清除能力作为指标,筛选合适的蛋白酶。

2.1.1 还原能力的测定 此方法的原理为[10]：

样品提供电子,使体系中 Fe3+还原成 Fe2+,在波长为 700nm下测定最终反应物的吸光度,吸光度越大,说明越多的 Fe3+被还原成 Fe2+,样品的还原能力就越强。一般情况,样品的还原能力与抗氧化能力呈正相关。

图 1显示,随着酶解时间的延长,由各蛋白酶酶解得到的大豆多肽表现出的还原能力分别逐渐加强,原因可能是随着水解程度的加深,更多的活性基团和位点暴露在外,提供电子的能力变强,表现出更强的还原能力。中性蛋白酶和碱性蛋白酶的酶解物表现出比较高的还原能力,菠萝蛋白酶的酶解物还原能力其次,胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶解物还原能力较低。原因可能是前三种酶的水解能力较强,在相同的时间内使更多的基团暴露在外;再有可能是前三种酶的酶切点,更有利于具有还原能力的活性基团或活性位点暴露出来。因此,从还原能力的角度,本研究选用中性蛋白酶、碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶。

图1 酶解物的还原能力

2.1.2 清除超氧阴离子自由基能力的测定 超氧阴离子自由基是生命代谢中对生物体危害很严重的一种自由基,清除超氧阴离子自由基的能力是检测样品抗氧化性的重要指标。

图 2显示,随着酶解时间的延长,由各蛋白酶酶解得到的大豆多肽表现出清除超氧阴离子自由基的能力分别逐渐加强,在酶解 10h时上升趋势还很明显,因此如果要得到清除超氧阴离子自由基的能力更强的大豆多肽,可以继续酶解。中性蛋白酶、菠萝蛋白酶和碱性蛋白酶的酶解物表现出比较高的超氧阴离子自由基的清除能力,胃蛋白酶清除能力最低,因此,从清除超氧阴离子自由基能力的角度,本研究选用中性蛋白酶、碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶。

图 2 酶解物的超氧阴离子自由基清除能力

2.1.3 清除过氧化氢能力的测定 过氧化氢与样品反应,过氧链保留并转移到样品分子上,样品生成新的过氧化物,被转移的过氧链越多,即样品接受过氧链的能力越强,说明样品的抗氧化能力越强。

图 3显示,随着酶解时间的延长,由各蛋白酶酶解得到的大豆多肽表现出清除过氧化氢的能力分别逐渐加强,胃蛋白酶在酶解 8h后酶解液清除能力上升趋势变缓,但其他四种酶上升趋势还很明显,因此要得到清除过氧化氢能力更强的大豆多肽,其它四种酶可以继续酶解。中性蛋白酶和碱性蛋白酶作用下的酶解物表现出比较高的过氧化氢清除能力,菠萝蛋白酶酶解物清除能力其次,但在 7h后超过了中性蛋白酶酶解物清除能力,胃蛋白酶、木瓜蛋白酶的清除能力最差。因此,从清除过氧化氢能力的角度,本研究选用中性蛋白酶、碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶。

图3 酶解物的过氧化氢清除能力

综上所述,本研究选择菠萝蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。

2.2 酶解条件的筛选

2.2.1 pH、底物浓度和温度的筛选 pH、底物浓度和温度是大豆蛋白酶解过程的重要影响因素,最适酶解条件可以保证实际生产中酶解的高效性。本实验选用 L9(34)正交表,以水解度为指标,对 2000U/g的碱性蛋白酶、2000U/g的中性蛋白酶和 1000U/g的菠萝蛋白酶三酶复合物的 pH、底物浓度和温度进行筛选,酶解时间为 6h,见表 1、表 2。

表 1 L9(34)正交实验因素水平设计

由表 2可知,三酶复合物酶解大豆蛋白的最适工艺条件是：酶解 pH 6.0,酶解温度 50℃,底物浓度8.0%。经统计分析,各因素对水解度影响的主次顺序为：底物浓度 ＞pH＞酶解温度,且底物浓度对酶解程度的影响非常大,pH、酶解温度对酶解程度的影响很小。

表 2 三酶复合酶解正交实验结果直观分析表

2.2.2 酶解时间的筛选 在最适温度、pH、底物浓度的酶解条件下,大豆蛋白得到最高效的酶解,以还原能力、清除超氧阴离子、双氧水能力为指标,筛选酶解时间,以期达到短时、高效得到抗氧化能力较强的大豆多肽。

2.2.2.1 还原能力的测定 由图 4可知,大豆蛋白酶解液的还原能力大于未酶解的大豆蛋白还原能力,且在 4h时酶解液的还原能力达到最大,前者为后者的 1.91倍。酶解 4h后酶解液还原能力逐渐变小,原因可能是在 4h后酶解液中具还原能力的基团和位点更多地暴露出来,但随着水解程度的加深,部分活性结构被破坏,酶解出的活性基团和位点其具有的还原能力不足以弥补被破坏的活性结构所具有的还原能力。因此在上述酶解条件下,4h为制备抗氧化大豆多肽的最适时间。

图4 样品还原能力的测定结果

2.2.2.2 清除超氧阴离子自由基能力的测定 由图 5可知,大豆蛋白酶解液清除超氧阴离子自由基的能力远大于未经酶解的大豆蛋白的清除能力,且在 4h时酶解液清除超氧阴离子自由基的能力达到最大,为未酶解大豆蛋白的 3.12倍,之后逐渐变小。因此经 4h酶解,可得到对超氧阴离子自由基有较强清除能力的大豆多肽。

图 5 样品清除超氧阴离子自由基能力的测定

2.2.2.3 清除过氧化氢能力的测定 由图 6可知,大豆蛋白酶解液清除过氧化氢的能力远大于未经酶解的大豆蛋白清除能力,且在酶解 4h时酶解液清除过氧化氢的能力达到最大,为未酶解大豆蛋白的 6.45倍,之后逐渐变小。因此经 4h酶解,可得到对过氧化氢有较强清除能力的大豆多肽。

图 6 样品清除过氧化氢能力的测定结果

以还原能力、清除超氧阴离子自由基和过氧化氢能力为指标,在最适酶解条件下,大豆蛋白经 4h酶解,制得的大豆多肽表现出的抗氧化性最强。

综上所述,选择 1000U/g菠萝蛋白酶、2000U/g中性蛋白酶、2000U/g碱性蛋白酶,在 pH 6.0,酶解温度 50℃,底物浓度 8.0%的酶解条件下,对大豆蛋白酶解 4h,抗氧化能力表现最强,还原能力达到0.898,对超氧阴离子自由基的清除率达到 40.93%,对过氧化氢的清除率达到 33.37%。

2.3 超滤分离

对分子量为 100kDa以上、10～100kDa、5～10kDa、5kDa以下 4部分的大豆多肽取相同的量,进行抗氧化能力测定。

由图 7～图 9可知,分子量分布在 10kDa以下的大豆多肽抗氧化能力表现较高,原因可能是小分子的多肽活性位点或基团更多地暴露在外,能充分和自由基等结合,所以多肽分子量的大小与抗氧化性有着密切的联系。具体为 10kDa以下 5kDa以上的多肽表现出更强的还原能力,而 5kDa以下大豆多肽表现出更强的清除超氧阴离子自由基和过氧化氢的能力。

图7 不同分子量大豆多肽的还原能力

10kDa以下的大豆多肽得率为 37.52%,产率较高,满足实际生产的要求。如需提高原料的利用率,可对 10kDa以上的大豆多肽进一步进行控制性水解。

3 结论

图 8 不同分子量大豆多肽的清除超氧阴离子自由基的能力

图 9 不同分子量大豆多肽清除过氧化氢的能力

3.1 选择 1000U/g菠萝蛋白酶、2000U/g中性蛋白酶、2000U/g碱性蛋白酶,三酶复合在 pH 6.0,酶解温度 50℃,底物浓度 8.0%的酶解条件下,对大豆蛋白酶解 4h,还原能力、超氧阴离子自由基和过氧化氢的清除率达到最高,表现出较高的抗氧化能力。

3.2 大豆蛋白酶解液的抗氧化能力远大于未经酶解的大豆蛋白的抗氧化能力,还原能力前者为后者的1.91倍,超氧阴离子清除率为 3.12倍,过氧化氢的清除率为 6.45倍。

3.3 10kDa以下 5kDa以上的多肽表现出更强的还原能力,而 5kDa以下的大豆多肽表现出更强的清除超氧阴离子自由基和过氧化氢的能力。

3.4 分子量分布在 10kDa以下的大豆多肽抗氧化能力表现较高,且得率较高,为 37.52%,满足实际生产需要。

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Study on preparation of soybean peptides w ith antioxidant activity

ZHOU Ting-ting,L IYan,SONG Fei
(College of Food Science and Technology,ShanghaiOcean University,Shanghai 201306,China)

Suitab le enzym e and hyd rolys is cond itions we re se lec ted for p rep a ring soybean p ep tides w ith antioxidant ac tivity bas ing on reduc ing ab ility,ab ility of scaveng ing sup e roxide free rad ica l and hyd rogen p e roxide.Results showed that the p ep tides,which showed highes t antioxidant activity,were p rep ared by1000U/g b rom e la in,2000U/g neutra l p rotease and 2000U/g a lka line p rotease toge the r for4h unde r the hyd rolys iscond itionsof pH6.0, temp e ra ture a t50℃ and subs tra te concentra tion a t8.0%.Reduc ing ab ility reached0.898,ab ility of scaveng ing sup e roxide free rad ica l40.93%and ab ility of scaveng ing hyd rogen p e roxide33.37% sep a ra te ly.Afte r ultrafiltra tion p ep tides less than10kDa and m ore than5kDa showed s tronge r reduc ing ab ility and p ep tides less than5kDa showed s tronge r ab ility of scaveng ing sup e roxide free rad ica l and hyd rogen p e roxide.

antioxidant ac tivity;soybean p ep tides;hyd rolys is;ultrafiltra tion

TS214.2

B

1002-0306(2010)03-0281-04

机体防御体系的抗氧化能力的强弱与健康程度存在着密切联系,该防御体系有酶促与非酶促两个体系。酶促体系中起作用的酶主要是超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽 S-转移酶(GST)等;非酶促反应体系中主要为维生素、多肽、氨基酸和金属蛋白质,例如：VE、VC、蛋氨酸、半胱氨酸、色氨酸、组氨酸、乳铁蛋白、转铁蛋白等。目前市场上的抗氧化剂大多为人工合成,例如VE、VC,作用效果好,但化学合成物质存在着安全隐患,它在清除自由基的同时也对人体的组织或器官产生副作用。研究表明,许多动植物的水解蛋白、个别肽和氨基酸都有抗氧化性[1]。大豆多肽具有较高的抗氧化能力,有研究结果表明,大豆多肽对脂质体系、非脂质体系、酶系统、非酶系统、体外实验均有显著的抗氧化作用[2]。因此相比较而言,没有副作用的生物活性肽更具优势。另一方面,抗氧化大豆多肽的生产缺乏技术基础,抗氧化多肽提取耗时久、得率低、效果差、成本高,导致现在市场上的大豆多肽产品处于初级开发阶段[3]。本实验旨在基于国内外研究,即对抗氧化多肽分子结构、分子大小与抗氧化生理功能的联系,达到短时、高产率、低成本制得具有较强抗氧化能力的大豆多肽,为抗氧化大豆多肽产品的进一步开发、生产奠定基础。

2009-05-06

周婷婷(1985-),女,硕士,研究方向：生物资源利用。