海金沙黄酮体外抗氧化活性研究

王桃云,陈 娟,彭志任,吴 琼,陈 鹏

(1.苏州科技学院,江苏苏州 215009;2.萍乡市林科所,江西萍乡 337000; 3.湘东区林业局,江西萍乡 337016;4.扬州大学,江苏扬州 225001)

海金沙黄酮体外抗氧化活性研究

王桃云1,陈 娟2,彭志任3,吴 琼1,陈 鹏4,＊

(1.苏州科技学院,江苏苏州 215009;2.萍乡市林科所,江西萍乡 337000; 3.湘东区林业局,江西萍乡 337016;4.扬州大学,江苏扬州 225001)

目的：研究海金沙黄酮(Flavones fromLygodium japonicum,FLJ)的制备与体外抗氧化活性。方法：通过回流法萃取和大孔吸附树脂纯化,得到纯化的 FLJ。以VC、BHT、芦丁和槲皮素为阳性对照,对羟基自由基、超氧阴离子自由基、烷基自由基的清除率以及抑制油脂过氧化的能力进行研究。结果：FLJ对上述自由基均有一定的清除作用,对羟基自由基、超氧阴离子自由基清除能力弱于VC、芦丁和槲皮素;对油脂抗氧化作用强于 BHT和 VC。浓度为 1.04mg/mL的 FLJ和VC对烷基自由基的清除能力相当。FLJ的添加量在实验范围内与其抗氧化活性呈正相关。结论：FLJ具有明显的体外抗氧化活性。

海金沙,黄酮,抗氧化活性,清除自由基,体外

1 材料与方法

1.1 材料与设备

芦丁、槲皮素、亚油酸 Sigma公司,色谱纯;三氯化铝、邻苯三酚、甲醇、乙醇、水杨酸、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、氯仿、乙酸、碘化钾、硫代硫酸钠、VC、BHT、FeSO4等 均为国产分析纯;猪油 市售,肥猪板油煎制;海金沙 10月中旬采自苏州市上方山森林公园。

UV-2450紫外-可见分光光度计 岛津仪器(苏州)有限公司;RE52-A旋转蒸发仪 上海亚荣玻璃仪器厂;101-1-BS型电热恒温鼓风干燥箱 上海跃进医学器械厂;FA2004N型电子天平 上海恒平科学仪器有限公司;GL-12B型台式离心机 上海飞鸽离心机厂。

1.2 实验方法

1.2.1 FLJ样品液的制备 将海金沙洗净,烘干,粉碎后过 100目筛,粉末于烘箱中干燥至恒重,称取10.00g海金沙干粉,加入 200mL 75%乙醇,85℃下恒温回流提取 4h,提取液在 5000r/min下离心 20min,得上清液,重复提取两次,将两次离心上清液合并,旋转蒸发浓缩至原体积的 1/4;加入等体积的石油醚,在分液漏斗中分层,弃上相,取下相。将下相液倒入烧杯中,用保鲜膜封口,于 4℃下静置 24h后,在5000r/min下离心 20min,得上清液,将上清液浓缩至原体积的 1/5,待用。

1.2.2 样液中 FLJ的纯化 选用AB-8型大孔吸附树脂对所得 FLJ溶液进行纯化,称取适量树脂,预处理后。以 70%乙醇装层析柱、平衡,用去离子水洗脱后,调 pH至 6.0。缓慢上样,用 3～4倍体积的去离子水洗去多糖、蛋白质等杂质。依次用 50%、60%、70%、80%、95%乙醇进行梯度洗脱,每次更换乙醇浓度前应检验终点。收集所有含 FLJ的洗脱液,旋转蒸发至所需的浓度。

1.2.3 标准曲线的绘制 精密吸取在 120℃干燥至恒重的芦丁对照品 0.2193g,置于 100mL的容量瓶中,加 10%的甲醇 70mL,置于水浴上微热至溶解,放冷,加 10%的甲醇稀释至刻度,摇匀。精确吸取10.0mL,置于 100mL容量瓶中,加蒸馏水稀释至刻度,摇匀,即得对照品溶液。

精密吸取已制备的对照品溶液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL,分别置于 25mL容量瓶中,各加 30%乙醇至 12.5mL,加 5%亚硝酸钠 0.7mL,混匀,静置 5min,加 10%硝酸铝 0.7mL,混匀,静置 6min,加 1mol/L NaOH 5mL,再加30%乙醇至刻度,混匀,静置 10min,用紫外分光光度计在 510nm处测定吸光度,绘制浓度 Y与吸光度X的标准曲线。

1.2.4 FLJ最佳吸收波长的确定 精密量取已制备的对照品溶液 1.0mL,置于 25mL容量瓶中,加 30%乙醇至 12.5mL,加 5%亚硝酸钠 0.7mL,混匀,静置5min,加 10%硝酸铝 0.7mL,混匀,静置 6min,加1mol/L NaOH 5mL,再加 30%乙醇至刻度,摇匀,静置 10min,用紫外分光光度计在 200～800nm范围内进行扫描,得扫描图。

1.2.5 FLJ对羟基自由基(·OH)清除率的测定[1]利用 H2O2对 Fe2+混合产生·OH,在体系内加入水杨酸捕捉·OH并产生有色物质,该物质在 510nm下有最大吸收。各试管中分别加入不同浓度的 FLJ溶液 2mL,9mmol/L水杨酸-乙醇 2mL,9mmol/L FeSO42mL,最后加入 8.8mmol/L H2O2启动反应,37℃反应0.5h,以蒸馏水为空白对照,在 510nm下测量各待测液的吸光度。考虑到本身的吸光值,以 9mmol/L水杨酸-乙醇 2mL,9mmol/L FeSO42mL,不同浓度的FLJ溶液 2mL为黄酮的本底吸收。清除率的计算公式为：

式中：A0为空白对照液的吸光度;Ax为加入黄酮溶液后的吸光度;Ax0为不加黄酮溶液本底的吸光度。

式中：A0为空白对照液的吸光度;A1为加入黄酮溶液后的吸光度。

1.2.7 FLJ对烷基自由基清除率的测定[3-4]取2.5mL 95%乙醇、2.5mL 0.1mol/L pH8磷酸缓冲液、0.05mL亚油酸和 0.5mL FLJ样品液,充分混合,用10W紫外灯照射 60min,然后加入 2mL三氯乙酸(20%)和 0.5mL硫代巴比妥酸 (3%,W/V),95℃水浴反应 90min,冰浴冷却,5000r/min离心 20min,于532nm波长处测定吸光度。空白组以等体积双脱氧水代替 FLJ样品液,以同浓度的芦丁和 VC作为对照。烷基自由基清除率的计算公式为：

式中：A0为空白组吸光度;Ai为加样品液组的吸光度。

1.2.8 FLJ抑制油脂氧化效果测定[5-6]称取已测定POV的猪油 4份,每份 40.0g置于 250mL的锥形瓶中,第 1份加入 6mL乙醇作为空白对照,第 2份加入6mL 0.5mg/mL VC,第 3份加入 6mL 0.5mg/mL BHT,第 4份加入6mL 0.5mg/mL FLJ,充分振摇后,置 65℃恒温干燥箱中,每隔 24h取 2.0g油样测定 POV值。每次取样后充分振摇锥形瓶,以混入足够的空气。油脂过氧化值 (POV)测定方法：按照 GB/T5538-1995的方法测定。

称取试样 2.0g,加入到 250mL锥形瓶中。在装有试样的锥形瓶中加入 10mL氯仿溶解试样,加入15mL乙酸和 1mL碘化钾饱和溶液,迅速盖好瓶塞,混匀溶液1min,在 25℃避光静置 5min。加入约75mL蒸馏水,以 0.5%淀粉溶液为指示剂,用硫代硫酸钠标准溶液滴定析出的碘,滴定过程要用力振摇。过氧化值计算公式为：

式中：V1是用于测定的硫代硫酸钠标准溶液的体积,mL;V2是用于测定猪油的硫代硫酸钠标准溶液的体积,mL;C是硫代硫酸钠标定浓度,mol/L;M是试样的质量,g。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线的制作

按 1.2.3所述方法,得标准曲线如图 1所示。

图1 芦丁标准曲线

由图 2可得回归方程为：Y=10.148x+0.0069, R2=0.9998,该标准曲线在 0.022～0.11mg/mL范围内有良好的线性关系。

2.2 FLJ最佳吸收波长的确定

由 1.2.4所述方法对 FLJ进行测定,所得光谱扫描结果如图 2所示。

图2 海金沙黄酮吸收光谱图

由图 2可知,在 200～600nm波长范围内,FLJ的吸收峰对应波长为 355nm,此波长即为 FLJ的最佳吸收波长。

2.3 FLJ对·OH的清除率

按1.2.5所述方法,得不同浓度下 FLJ、VC和槲皮素对·OH的清除率,如图 3所示。

图3 FLJ、VC、槲皮素对·OH的清除率

从图 3可知,随着三种物质在反应液中浓度的增加,对·OH的清除率呈上升趋势,当 VC浓度为0.11mg/mL时,其·OH清除率趋近于 100%,此时FLJ和槲皮素的·OH清除率分别是 10%和 22%,因此,FLJ对·OH具有一定的清除力,但作用效果比VC和槲皮素差。

按1.2.6所述方法,得不同浓度下 FLJ、VC和芦丁对的清除率,如图 4所示。

图 4 FLJ、芦丁、VC对·的清除率

由图 4可知,FLJ、VC和芦丁对·均有不同程度的清除作用,而且这三种抗氧化剂对·的清除作用与其浓度呈量效关系,清除率随着其浓度的提高而增大。当抗氧化剂浓度为 1.04mg/mL时,FLJ、芦丁和VC对·的清除率分别为：59.5%、82.6%和98.8%,芦丁和VC的清除作用都强于 FLJ。同时,随着浓度的增大,FLJ对·清除作用的增长趋势比芦丁和 VC强。因此,FLJ对·具有较好的清除作用。

2.5 FLJ对烷基自由基的清除率

按 1.2.7所述方法,分别对不同质量浓度的 FLJ、VC和芦丁对亚油酸氧化体系的抑制能力进行实验,结果如图 5所示。

图 5 FLJ、芦丁、VC对烷基自由基的清除率

从图 5可知,FLJ、芦丁和VC对烷基自由基引发的亚油酸氧化体系均有不同程度的抑制作用,在实验浓度范围内,三种抗氧化剂在实验浓度范围内对烷基自由基的清除率随各自浓度的提高而增大,且在不同浓度范围内,清除率有显著差异。当三种抗氧化剂的浓度达到 1.04mg/mL时,FLJ、芦丁和VC对烷基自由基的清除率分别达到 57.01%、67.72%和58.84%,FLJ与芦丁和VC对烷基自由基的清除效果相当。因此,FLJ对烷基自由基具有较好的清除作用。

2.6 FLJ抑制油脂氧化效果

油脂暴露在空气中易氧化形成自由基,自由基与空气中的氧反应生成自由基和过氧化物,可以用油脂的 POV值来评价其氧化程度,POV值越小,则油脂被氧化的程度越小。按 1.2.8所述方法,得不同浓度下VC、BHT和 FLJ抑制油脂氧化效果,结果如图6所示。

由图 6可知,空白样在没加抗氧化剂时,油脂的POV随着时间的延长不断升高。加入抗氧化剂 FLJ、VC和BHT后,油脂的 POV在 7d后随时间的延长而增加程度明显比空白要低,且经 FLJ处理的油脂的POV值明显比BHT和VC处理的油脂 POV值低。因此,FLJ对抑制油脂氧化具有良好的效果。

图6 FLJ、VC、BHT对油脂氧化的抑制作用

3 结论

体外抗氧化实验结果表明,FLJ有一定的的清除羟基自由基、超氧阴离子自由基作用;具有较强的清除烷基自由基以及抑制油脂过氧化的能力;FLJ作为抗氧化功能因子在保健功能食品中的应用前景广阔。

[1]高荫榆,洪雪娥,罗丽萍,等 .甘薯叶柄藤类黄酮的体外抗氧化作用研究[J].食品科学,2006,27(7)：103-106.

[2]严建刚,张名位,杨公明,等 .芹菜黄酮的提取条件及抗氧化活性研究[J].西北农业科技大学学报：自然科学版,2005, 33(1)：32-36.

[3]张勇,王纯钢,冯冲,等 .红三叶黄酮抗氧化性研究[J].食品科技,2006(4)：78-81.

[4]王绍美 .茶多酚与VC对猪油乳化体系协同抗氧化性研究[J].食品工业科技,2000,21(6)：24-27.

[5]许宗运 .七种植物提取物对猪油的抗氧化性研究[J].塔里木农垦大学学报,2003,15(4)：1-5.

[6]赵声兰 .核桃油自氧化及其抗氧化的实验研究[J].食品工业科技,2001,22(2)：27-29.

Study on antioxidant activity of flavones from Lygodium japonicum in vitro

WANG Tao-yun1,CHEN Juan2,PENG Zhi-ren3,W U Qiong1,CHEN Peng4,＊
(1.Suzhou Science and TechnologyUniversity,Suzhou 215009,China; 2.The Forestry Research Institute of Pingxiang,Pingxiang 337000,China; 3.ForestryBureau of Xiangdong County,Pingxiang 337016,China; 4.Yangzhou University,Yangzhou 225001,China)

O b jec tive：To s tudy the antioxidant ac tivities of FLJ in vitro.M e thods：The FLJ was extrac ted by m e thod of reflux extrac tion and p urified by m ac rop orous adsorp tion res in.The scaveng ing cap ac ities on hyd roxyl free rad ica l, sup e roxide anion rad ica l and a lkyl rad ica l as we ll as inhib ition of POV va lue of the FLJ we re de tec ted while the VC, BHT,que rce tin and rutin flavonoids we re used as p os itive control.Results：The FLJ had som e scaveng ing ab ility on a ll rad ica l had been s tud ied in this exp e r im ent.The scaveng ing ac tivity on hyd roxyl free rad ica l,sup e roxide anion rad ica lwas weake r than VC,que rce tin and rutin flavonoids.W hen the concentra tion was1.04m g/mL the FLJ and VChad equiva lent effec ts on the a lkyl rad ica l.But the FLJ had s tronge r antioxidant ac tivities on inhib ition of POV va lue than BHT and VC.The am ount of FLJ used was in d irec t p rop ortion to the antioxida tion.Conc lus ion：The FLJ had rem a rkab le in vitro antioxidant ac tivity.

Lygod ium jap onicum;flavones;antioxidant ac tivity;scaveng ing cap ac ity to rad ica l;in vitro

TS201.2

A

1002-0306(2010)03-0193-04

海金沙 (Lygodium japonicum)系海金沙科(Lygodiaceae)多年生蕨类植物,海金沙草是海金沙植物的地上部分。资料报道,海金沙中含有黄酮类化合物,而黄酮类化合物是人体所必需的营养素之一,但人体自身不能合成,只能从食物中摄取,黄酮类化合物具有抗氧化、清除体内自由基、抗衰老抗心律失常、降血糖、降血脂等功效。近年来,研究自由基及其抑制剂、清除剂和动力学机制逐渐成为生物及医学研究中的一个新方向,越来越受到人们关注,并取得了一定的研究成果。本实验利用回流法萃取的海金沙黄酮,对其体外抗氧化活性进行研究,旨在为海金沙综合开发利用提供理论依据。

2009-06-01 ＊通讯联系人

王桃云 (1973-),男,讲师,在读博士研究生,研究方向：生物化学技术与天然产物研究与开发。