植物提取物对芒果致腐菌的抑制作用研究

李奥峰,黄 丽,滕建文,韦保耀

(广西大学轻工与食品工程学院,广西南宁 530004)

植物提取物对芒果致腐菌的抑制作用研究

李奥峰,黄 丽＊,滕建文,韦保耀

(广西大学轻工与食品工程学院,广西南宁 530004)

对植物提取物在抑制芒果病害领域进行了初步研究。以芒果褐色蒂腐菌 (Phomopsis mangiferae Ahmad)和胶孢炭疽菌(Collgtotrichum gloeosporioides Penz)为研究对象,采用管蝶法评价 30种植物的水提物和醇提物的离体抑菌效果。并使用孔板连续培养法测定相应的最低抑菌浓度(M IC)和最低杀菌浓度(MBC)。结果表明：有 14种水提物和 7种醇提物对芒果致腐菌有抑制作用。其中丁香、肉豆蔻、金银花、知母、白芷、虎杖、乌梅、牡丹皮、黄连、藿香的水提物以及肉豆蔻、黄岑、大黄、桂皮、丁香的醇提物对胶孢炭疽菌均有抑制效果;丁香、桂皮、金银花、牡丹皮、知母、肉豆蔻的水提物以及肉豆蔻、芦荟、大茴香的醇提物对褐色蒂腐菌有不同程度的抑制作用。

植物提取物,芒果,褐色蒂腐菌,胶孢炭疽菌,抑菌

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

芒果褐色蒂腐菌 (Phom opsis m angiferae Ahm ad)取自广西大学农学院微生物保藏实验室;芒果胶孢炭疽菌 (Collgtotrichum gloeosporioides Penz) 取自广西农科院;30种植物的水提物和醇提物粉末 均购自西安和霖生物工程有限公司,均为标准制备工艺生产的天然植物提取物,分别是丁香、黄芩、桂皮、高良姜、大茴香、板蓝根、金银花、黄连、五倍子、藿香、厚朴、白芷、芦荟、益母草、肉豆蔻、苍术、苦参、鱼腥草、百部、虎杖、黄连、白背叶、益智、山柰、三七、乌梅、鹿蹄草、龙胆草、大黄、牡丹皮。

YXQ-LS-5051型立式压力蒸汽灭菌器,HDP-2000型恒温培养箱,水平层流净化工作台,电冰箱,酒精灯,培养皿,试管,涂布棒,移液枪,12孔板,接种环,牛津杯,琼脂粉,蔗糖等。

1.2 实验方法

1.2.1 菌悬液的配制 取斜面培养的对数期生长旺盛的病原菌,吸取生理盐水 20mL将斜面上孢子冲洗到三角瓶中,再加入 80mL生理盐水加以稀释,在洗斜面孢子时可用灭菌接种环适当刮洗。以此为菌悬液主液,制成一系列梯度浓度的标准菌悬液。将盖玻片盖在血球计数板计数室上面,用细口滴管吸取少量充分振荡混匀的菌液,滴加在盖玻片的边缘上,让菌液由盖玻片与计数板的缝隙间渗入计数室,静置片刻,待菌体自然沉降并稳定后开始计数。做 2次平行实验,每次实验做 3个重复,取平均值。最终获得孢子含量为 106～107cfu/mL的菌悬液[5]。

1.2.2 管碟法测定植物提取物对芒果病原菌生长的抑制作用 吸取 200μL的指示菌菌悬液至 PDA平板上,用无菌玻耙涂布均匀,并用镊子将无菌的牛津杯轻轻放入培养皿中,在水平放置的平皿中均匀地放置 3只牛津杯。用无菌水将提取物稀释为 100mg/mL浓度的溶液,每种取 200μL至牛津杯中,对照组(CK)的牛津杯中加 200μL无菌水,阴性对照组 1 ()使用稀释度为 1∶700的多菌灵,阴性对照组 2 ()使用稀释度为 1∶700的扑海因,每种植物提取物进行三次平行实验。注意不要将液体溢出牛津杯外,然后将平板置于最适生长温度 28℃下培养,胶孢炭疽菌培养48h,褐色蒂腐菌培养60h,根据十字交叉法用游标卡尺测定抑菌圈的大小[6]。

1.2.3 孔板连续培养法测定植物提取物对芒果病原菌生长的最低抑菌浓度 (M I C)和最低杀菌浓度(MBC) 采用 12孔板连续稀释法[7]。以无菌水为溶剂,配制一系列梯度浓度的提取物溶液,将该梯度浓度的提取物溶液加入已融化好的液体 PDA培养基中,在每一提取物浓度梯度作 3组平行实验,向每个孔中依次加入 300μL的提取物溶液与培养基的混合溶液和 10μL的菌悬液。对照组 (CK)添加无菌水,阴性对照组 1()添加多菌灵,阴性对照组 2 ()添加扑海因,用保鲜袋封口,28℃下培养 48h,观察结果,与三个对照组比较,有菌落生长者无抑制作用,以完全没有菌生长的最低提取物浓度为其最低抑菌浓度(M I C),继续培养36h后,取0.2mL涂布PDA平板,如仍不长菌的即为最低杀菌浓度(MBC)[8]。

2 结果与分析

2.1 管碟法测定植物提取物对芒果病原菌生长的抑制效果

采用 SPSS17.0的 Duncan Test及单因素方差分析对 1～30号提取物各自的抑菌效果进行分析,筛选出有效的提取物并记录各自的效力,结果见表 1和表2。

由表 1可以看出,在 30种植物水提取物中,有抑制效果的有 14种。对胶孢炭疽菌有效用的有 10种,其中虎杖、知母、白芷具有等效的抑制作用 (同为 E级);乌梅、牡丹皮具有等效的抑制作用 (同为 D级);丁香水提取物的抑菌圈最大 (9.11mm),抑菌效果最好;丁香、肉豆蔻、金银花、知母、白芷、虎杖、乌梅、牡丹皮、黄连、藿香对胶孢炭疽菌的抑制作用依次减弱。与对比实验的两种广谱农药的效果相比,丁香,肉豆蔻,金银花的抑菌效果要稍好于扑海因,但是远低于多菌灵。

表 1 植物水提物对芒果致腐菌的离体抑菌效果

表 2 植物醇提物对芒果致腐菌的离体抑菌效果

对褐色蒂腐菌有效用的水提取物有 9种,丁香、桂皮、金银花、牡丹皮、知母、肉豆蔻、益智、黄岑、高良姜的抑制效果逐渐降低。丁香的抑菌效果最好,抑菌圈为 10.41mm。与对比实验的两种广谱农药的效果相比,丁香、桂皮、金银花、牡丹皮、知母、肉豆蔻的效果比扑海因明显,但是远低于多菌灵。

由表 2可以看出,在 30种植物醇提物中,有 7种对芒果致腐菌有抑制作用。对胶孢炭疽菌有效用的有 6种,丁香、桂皮具有同样的抑菌效果 (同为 D级);肉豆蔻、黄岑、大黄具有等效的抑菌效果 (同为E级);肉豆蔻醇提物的抑菌圈为 9.57mm,其抑菌效果最好;肉豆蔻、黄岑、大黄、桂皮、丁香、芦荟的抑菌效果逐渐降低。与对比实验的两种广谱农药的效果相比,肉豆蔻、黄岑、大黄、桂皮、丁香这 5种醇提物的抑菌效果均比扑海因好,比多菌灵差。

对褐色蒂腐菌有效用的醇提取物有 3种,肉豆蔻、芦荟、大茴香的抑制效果逐渐降低;肉豆蔻的抑菌效果最好,抑菌圈为 14.25mm。与对比实验的两种广谱农药的效果相比,肉豆蔻、芦荟、大茴香的效果明显比扑海因高,但是稍低于多菌灵。

实验结果表明,不同种类植物提取液对同一芒果致腐菌的抑制作用存在着差异,同一植物用不同溶剂提取得到的物质对同种病原菌的抑菌活性亦存在较大差异。对于供试相同质量浓度的植物提取液,对褐色蒂腐菌的抑制作用明显强于胶孢炭疽菌,说明两种芒果致腐菌的生命力和抗药性存在显著性差异。

2.2 孔板培养法测定有抑菌效果的植物提取物的M IC、MBC

在上述实验的基础上,筛选出对褐色蒂腐菌和胶孢炭疽菌有抑制效果的植物提取物,对其最低抑菌浓度(M I C)和最低杀菌浓度 (MBC)进行测定,结果如表 3和表 4所示。

表 3 有效的植物水提物对芒果致腐菌的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度

表 4 有效的植物醇提物对芒果致腐菌的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度

由表 3可以看出,在对褐色蒂腐菌有抑制效果的水提物中,褐色蒂腐菌对丁香和肉豆蔻最为敏感,其最低抑菌浓度最小,为 50mg/mL;桂皮、金银花、牡丹皮水提物的最低抑菌浓度同为 100mg/mL,其中金银花的最低杀菌浓度大于 200mg/mL。在对胶孢炭疽菌有抑制效果的水提物中,丁香、金银花、肉豆蔻、乌梅的最低抑菌浓度最小,同为 50mg/mL;金银花的最低杀菌浓度最小。

由表 4可以看出,在对褐色蒂腐菌有抑制效果的醇提物中,肉豆蔻、黄岑、大黄醇提物的最低抑菌浓度最小,同为 25mg/mL,并且肉豆蔻醇提物的最低杀菌浓度最小。丁香、桂皮醇提物的最低抑菌浓度同为 50mg/mL,最低杀菌浓度同为 100mg/mL。可见褐色蒂腐菌和胶孢炭疽菌均对肉豆蔻醇提物最为敏感。

多菌灵对这两种芒果致腐菌表现出了极高的杀菌效力,其最低抑菌浓度和最低杀菌浓度均为本实验的最小稀释浓度。

3 结论

本研究通过对芒果胶孢炭疽菌的离体抑菌实验,筛选出了对其有抑菌效果的 10种水提物和 6种醇提物。水提物的抑菌效果强度由强到弱为：丁香、肉豆蔻、金银花、知母、白芷、虎杖、乌梅、牡丹皮、黄连、藿香;醇提物对胶孢炭疽菌的抑菌效果强度由强到弱为：肉豆蔻、黄岑、大黄、桂皮、丁香、芦荟。通过对芒果褐色蒂腐菌的离体抑菌实验,筛选出了对其有抑菌效果的 9种水提物和 3种醇提取物。水提物的抑菌效果强度由强到弱为：丁香、桂皮、金银花、牡丹皮、知母、肉豆蔻、益智、黄岑、高良姜;醇提物的抑菌效果强度由强到弱为：肉豆蔻、芦荟、大茴香。褐色蒂腐菌和胶孢炭疽菌均对肉豆蔻醇提物最为敏感,当肉豆蔻醇提物的浓度为 25mg/mL时,可杀死全部的芒果致腐菌。

同一种植物用不同的溶剂进行提取,获得的有效抑菌成分也不尽相同,如本实验中肉豆蔻的醇提物的抑菌效果远好于其水提物。而大黄水提物对胶孢炭疽菌的没有抑制作用,而醇提物对其抑制作用却很明显。原因可能是用水提取的生物碱盐、甙类、有机酸类、氨基酸、多糖类等物质比较杂,有些物质对真菌的抑制能力不强;而醇提取的盐、甙类、挥发油及有机酸类的活性物质能侵入微生物的细胞质膜,使其细胞膜蛋白质结构遭到破坏,抑制了微生物的 TCA呼吸途径中酶的活性,阻断了糖代谢途径,使其不能生长繁殖。

在筛选天然植物保鲜剂时,不能只注重室内抑菌实验筛选结果,离体实验中抑菌作用强的提取物保鲜剂,对芒果活体采后病害的防治效果却很难预料。因此有必要结合其在采后防腐的实际应用效果,对天然植物的抗菌作用机理、构效关系、化学仿生合成等进行细致深入的研究。用植物中提取有抑菌作用的活性物质,直接或间接加工合成的新型保鲜剂,使其具有在环境中生物降解快,对人畜及非靶标生物毒性低,不易产生抗性等优点,为天然植物提取物在果蔬保鲜方面的真正实践应用提供基础。

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Study on inhibition effect of plant extracts againstm ango pathogens

L IAo-feng,HUANG L i＊,TENG Jian-wen,W EI Bao-yao
(Institute ofLight Industry and Food Engineering,GuangxiUniversity,Nanning 530004,China)

The s tudy eva lua ted the ant im ic rob ia l ac tivity of30kinds of p lants’wa te r extrac ts and e thanol extrac ts aga ins t Phom op s is m ang ife rae Ahm ad,Collg totrichum g loeosp orioidesPenz by cup-p la te m e thod in vitro exp e r im ents.O rifice Pla te continuous culture m e thod was used to de te rm ine the irm in im um inhib ition concentra tion (M IC)and m in im a l bac te ric ida l concentra tion(MBC).In vitro exp e r im ents showed tha t14kinds of p lants’wa te r extrac ts and 7kindsof e thanol extrac tshad inhib ition effec tsaga ins t Phom op s is m ang ife rae Ahm adsand Collg totrichum g loeosp orioides Penz.Syringa,M yris tica,Lom ice ra,Rhizom a,Ange lica,Polygonum,Prunus,Cortex m outan,Cop tis,Agas tache’wa te r extrac ts as we ll as M yris tica,Scute lla ria,Rheum,C innam om um cass ia,Syringa’e thanol extrac ts had inhib ition effec ts aga ins t Collg totrichum g loeosp orioides Penz;Syringa,C innam om um cass ia, Lom ice ra,Cortex m outan,Rhizom a,M yris tica’wa te r extrac ts as we ll as M yris tica,A loe,Illic ium’e thanol extrac ts have inhib ition effec ts aga ins t Phom op s is m ang ife rae Ahm ad.

p lantextrac ts;m ango;Phom op s is m ang ife rae Ahm ad;Collg totrichum g loeosp orioides Penz; bac te ria l inhib ition

TS255.3

A

1002-0306(2010)03-0076-04

芒果极不耐贮运,采后易发生腐烂变质,长期以来,芒果的贮藏保鲜问题一直未能得到很好的解决,这不仅造成资源损失、环境污染,而且致使大量芒果收获后无法进入全国性供应。由病原微生物引起的病理性病害是造成芒果腐败变质的主要原因,芒果炭疽病和芒果蒂腐病是果生产区发生最普遍、危害性最大的一种病害,在我国各芒果种植区均有发生[1]。我国植物资源十分丰富,可供于开发利用的资源非常多。近年来,国内外对于有天然抗菌保鲜剂的应用研究十分盛行,Hammer[2]对 52种植物精油的抗菌活性进行了研究,发现岩兰草油、胡荽、月见草、杏树油、牛至、丁香等精油对金黄色葡萄球菌、黄曲霉菌等微生物有显著的抑制作用。Ates[3]对几种药用植物提取液的抗菌活性研究中发现,桂皮提取液对芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等有抑制作用。孔秋莲[4]等发现丁香、肉桂的提取物可抑制黑曲霉和扩展青霉的孢子萌发,五倍子、川芎的提取物可抑制黑曲霉和扩展青霉的孢子形成。通过查阅相关的文献,选取了 30种抑菌效果较好的植物水提物和醇提物作为抑菌剂,进一步扩大了活性物质获得的范围。将芒果病害研究和天然植物提取物贮藏保鲜应用研究进行有机结合,从中筛选出有效的植物种类,解析抑菌效果,为研究这些提取物中的有效成分和活性物质,进一步筛选确定其化学成分和物质的结构奠定基础,为克服芒果贮藏过程的病害发生以及开发天然芒果保鲜剂等提供理论依据。

2009-06-29 ＊通讯联系人

李奥峰(1984-),男,硕士研究生,研究方向：亚热带水果蔬菜保鲜技术。

国家科技部攻关百色专项;广西科技攻关项目 (桂科攻0424006-1D)。