乌司他丁对体外循环下心肌缺血再灌注损伤患者基质金属蛋白酶-9的影响

孙 亮,刘 萍,常忠路,张衍鲁,陈庆伟

体外循环(extracorporeal circulation,ECC)下心肌缺血再灌注损伤主要与钙超载、氧自由基大量产生和内皮细胞激活有关。近年研究表明金属蛋白酶(MMPs)的表达及活性增强,参与心肌缺血再灌注损伤的发展过程。在ECC期间如何防治心肌缺血再灌注损伤的发生发展一直为心脏外科医师所关注。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)是一组锌离子依赖性的蛋白水解酶家族,其主要功能是参与细胞外基质的降解,对于生理情况下细胞外基质动态平衡的维持有重要的作用。MMP-9是 MMP家族的重要成员,其主要功能是降解Ⅳ型胶原,与多种生理和病理过程有[1-2]。近年来,有关 MMP在ECC心肌缺血再灌注损伤中的作用逐渐受到重视。乌司他丁(ulinastatin,UTI)是一种广谱的蛋白酶抑制剂,对胰蛋白酶、纤溶酶、激肽释放酶等有较强的抑制作用,稳定溶酶体膜,从而抑制了多种炎性介质释放对组织器官的损害,UTI对由于 ECC导致的各种蛋白酶及炎性介质对机体的损伤有明显的抑制作用。本研究旨在探讨 UTI对围 ECC期患者血浆中MMP-9变化的影响。

1 对象与方法

1.1 试剂、药品与器械 注射用 UTI(天普洛安,100 ku/支,粉针剂,广东天普生物化学医药股份有限公司生产)。血浆 MMP-9含量采用 ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。Drager麻醉机 Fabius 2 000(德国 Drager公司生产的电动电控型)。StockertⅢ人工心肺机(Stockert公司,德国)和希健-Ⅰ膜式氧合器(西京公司,中国)。

1.2 对象及分组 收集本院心脏外科 2008年1月至 11月接受 ECC下行心脏手术的患者 30例,男 18例,女 12例。其中双瓣置换术 10例,单瓣置换术12例,法洛四联症根治术 4例,冠状动脉旁路移植术 4例。排除标准:术前有肝、肾功能障碍、糖尿病、系统性红斑狼疮及其他内分泌系统疾病、长期使用激素史、慢性支气管炎、哮喘史、近期有肺部感染、ECC时间短于 30 min或长于 150 min者。以随机概率表随机分为 UTI组和对照组,每组 15例。UTI组按患者体重 12 ku/kg计算总用量,用 20m l生理盐水稀释后,在颈内静脉插管成功后麻醉诱导时由颈内静脉缓慢推入总量的 1/2,ECC开始时即刻将剩余量 1/2加入预充液中。相对应注入等量的生理盐水作为对照组。

1.3 麻醉与ECC方法 所有患者术前常规禁食8 h,禁饮 6 h,麻醉前 30 min肌注吗啡 0.1 mg/kg,东莨菪碱 0.007mg/kg。气管插管、静脉复合麻醉,麻醉诱导用药为咪哒唑仑 0.03～0.05mg/kg,依托咪酯 0.3 mg/kg,舒芬太尼 0.6～1μg/kg,哌库溴铵0.15mg/kg,麻醉维持采用静脉方法,间断静注舒芬太尼,持续泵注异丙酚 3～5 mg/(kg·h),间断追加哌库溴铵维持肌松。麻醉成功后正中剖胸,肝素化(3mg/kg)至活化凝血时间(ACT)＞400 s,升主动脉及上、下腔静脉置管常规建立 ECC,中或浅低温(24～32℃),中度血液稀释[红细胞比容(Hct)为0.2～0.3],非搏动灌注,流量为 60～90m l/(kg·min)。心脏停搏液采用 4℃晶体高钾停搏液于主动脉根部灌注,使心电呈等电位,心脏局部敷冰屑维持心肌局部深低温。心内操作完成后左心排气,开放升主动脉,复温至36℃停止 ECC。常规用鱼精蛋白 1：1比例拮抗肝素,必要时追加少量鱼精蛋白。

1.4 标本采集与指标测定 分别记录切皮至 ECC开始时间,ECC的时间,主动脉阻断时间,手术时间,观察术后患者的预后等。分别在 ECC开始前(T1)、主动脉阻断前 1 Min(T2)、主动脉开放后 1 min(T3)、ECC结束时(T4)、ECC结束后 2 h(T5)及 6 h(T6)6个时间点各采集 5ml动脉血置于肝素化试管中,1 h内离心(3 000 r/min,10min),取血浆样本置于-70℃下保存备用。标本复温后集中按照试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)使用说明,采用 ELISA法检测样本中 MMP-9的浓度。测定值按 Taylor公式校正,公式为:

稀释后物质含量校正值 =实测值 ×术前 Hct/取样时 Hct

1.5 统计学方法 应用 SPSS 10.0统计软件分析,所有计量资料用均数±标准差(±s)表示。组内比较采用重复测量数据方差分析,组间比较采用单因素方差分析,P＜0.05为差异有显著性。

2 结 果

2.1 两组患者临床资料比较 两组患者的年龄(44.2±10.6)岁 vs(45.1±11.3)岁 、男 /女性别比(9/6)例 vs(9/6)例、体重(54.7±10.3)kg vs(55.2±11.4)kg、手术类型(双瓣置换术每组各 5例、单瓣置换术每组各 6例、法洛四联症根治术每组各 4例、冠状动脉旁路移植术每组各 2例)、ECC时间(77.9±25.4)min vs(76.7±24.1)min、主动脉阻断时间(55.3±18.7)min vs(57.1±19.2)min、手术时间(220.6±40.1)Min vs(230.9±45.7)min,均无统计学差异(P＞0.05)。

2.2 两组患者不同时间点血浆 MMP-9浓度比较 所有患者术中经过顺利,围术期循环功能维持良好,两组患者均无术后早期死亡。两组患者MMP-9浓度在 T2、T3、T4、T5和 T6均较 T1时明显升高(P＜0.05),均在 T4时达高峰。两组MMP-9浓度在 T1时差异无显著性(P＞0.05)。UTI组在 T2、T3、T4、T5和 T6时均明显低于对照组(P＜0.05)。见表1。

3 讨 论

目前 ECC下心肌缺血再灌注损伤仍是一个难以避免的并发症,在 ECC期间如何防治心肌缺血再灌注损伤的发生发展一直为心脏外科医师所关注。所以适当应用药物干预对预防和减轻心肌缺血再灌注损伤具有重要的临床意义。

表1 两组患者不同时点血浆MMP-9浓度(ng/L,n=15,±s)

表1 两组患者不同时点血浆MMP-9浓度(ng/L,n=15,±s)

注:与对照组比较*P＜0.05;与T1比较#P＜0.05

对照组 50.8±11.2 80.6±21.5# 171.3±53.2# 403.9±132.3# 310.9±61.3# 142.3±48.6#UTI组 51.4±12.3 60.5±15.6*# 102.3±23.4*#213.8±71.6*# 122.9±30.3*# 73.2±18.7*#

MMP-9,又称明胶酶 B,是 MMPs的主要成员,定位于人 16号染色体,它是 MMP家族中分子量最大的酶。分子量为 92 KDa大小,它以前酶原(80 KDa)的形式合成。含有一个 19个氨基酸的信号肽,后经裂解掉此信号肽,多糖氨基化而变成 92 KDa的酶原形式。92 KDa的酶原降解掉氨基酸端 73个氨基酸产生酶的活化形式(84 KDa)[3]。它作用底物广泛,包括 Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ型胶原、明胶、弹性蛋白等。MMP-9有 7个片段组成:信号肽片断、一个裂解成激活酶的前肽片断、锌结合片断、激活酶片断、纤维连接片断、类Ⅴ型胶原片断、带有羧基末端类血凝酶片断,但这些片段的具体结构功能尚未明确[3]。在正常情况下,MMP-9释放量很少[4]。

心肌缺血再灌注损伤主要与钙超载、氧自由基大量产生和内皮细胞激活有关。近年研究表明MMPs的表达及活性增强,参与心肌缺血再灌注损伤的发展过程。Lu[5]等研究发现,体内猪心脏遭受 90 min的缺血,再灌注 90min后,心肌中的 MMP-9含量增加、酶活性增强,此与缺血再灌注心肌组织中MMPs组织抑制剂的含量减少及组织纤溶酶原激活物表达增高引起的瀑布效应有关。Romanic等[6]研究亦显示 MMP-9基因缺失能有效的保护缺血再灌注对心肌损伤的影响。MMP-9基因缺失鼠在心肌缺血 30min再灌注 24 h后,心肌梗死面积比野生型鼠减少了 35.4%,内源性 MMP-9抑制剂的表达量是野生型鼠的 21.4倍。本实验结果显示,主动脉阻断前 1min至 ECC后 6 h两组患者 MMP-9浓度均较麻醉诱导前明显升高,两组均在主动脉开放后ECC结束时达高峰,其机制可能是因为心肌经受了缺血再灌注损伤的打击而发生组织损伤,血管内皮组织损伤,或组织细胞产生大量的生物活性物质(组织因子、氧自由基、蛋白酶),促进全身炎症反应并造成心肌组织损伤,这些都可能合成和释放 MMP-9,成为 MMP-9增多的原因。这与先前的报道相一致。Lindsey等[7]通过动物实验证实再灌注后 1 h MMP-9在血清及心肌组织中均增高,中性粒细胞浸润是缺血再灌注损伤后 MMP-9的早期来源,在心肌层 MMP-9的一部分为激活型。中性粒细胞浸润通过 MMP-9分泌型使 MMP-9聚集,是蛋白酶活化的来源。ECC过程中中性粒细胞激活释放大量的 MMP-9,降解Ⅳ型胶原,破坏内皮基底膜,导致组织水肿,在 ECC中 MMP-9的释放明显增加[8]。

乌司他丁是由 Beuer和 Reich于 1909年在人类尿液中发现的一种典型的 Kuniz型蛋白酶抑制剂,具有两个活性功能区。两个活性功能区均有广谱抑酶作用,且不完全重叠,能够同时抑制胰蛋白酶、磷脂酶 A2、透明质酸酶、弹性蛋白酶等多种蛋白酶的活性。乌司他丁降解形成的分子产物仍对上述各种蛋白酶有高效抑制作用,能改善休克时的微循环状态,对溶酶体膜有稳定作用。大量研究表明,UTI具有抑制多种蛋白、糖和脂类的水解酶的活性,抑制炎性介质的过度释放及改善微循环和组织灌注的药理作用,从而在 ECC中保护机体免受全身炎症反应的损伤[9]。本实验结果显示,乌司他丁组主动脉阻断前 1 min至 ECC结束后 6 h时 MMP-9的浓度均明显低于对照组,说明乌司他丁在 ECC过程中可明显抑制 MMP-9的过度释放。其机制可能为:乌司他丁通过稳定溶酶体膜,抑制众多酶活性,抑制粒细胞弹性蛋白酶和细胞自溶素 G,阻止中性粒细胞、单核粒细胞和巨嗜细胞聚集,预防细胞因子级联反应,抑制白细胞过度激活及炎性介质的释放,阻断细胞因子、炎性介质与白细胞之间的恶性循环,从而抑制 MMP-9释放和激活。Miura[10]也在研究中发现乌司他丁对由于 ECC介入而导致的各种蛋白酶及炎性介质对机体的损伤有明显的抑制作用,应用乌司他丁后能明显抑制肿瘤坏死因子-α的过度释放,抑制中性粒细胞大量聚集和中性粒细胞脱壳粒作用,从而抑制 MMP-9的释放。

本研究表明,ECC可致血浆中 MMP-9的浓度升高,而乌司他丁能明显降低围体外循环期患者 MMP-9的过度释放,可能减轻心肌缺血再灌注损伤。

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