高效液相色谱-电喷雾串联质谱法检测环境水样中22种抗生素类药物

高立红, 史亚利, 厉文辉, 刘杰民, 蔡亚岐＊

(1.中国科学院生态环境研究中心环境化学与生态毒理学国家重点实验室,北京100085;2.北京科技大学土木与环境工程学院,北京100083)

高效液相色谱-电喷雾串联质谱法检测环境水样中22种抗生素类药物

高立红1,2, 史亚利1, 厉文辉1, 刘杰民2, 蔡亚岐1＊

(1.中国科学院生态环境研究中心环境化学与生态毒理学国家重点实验室,北京100085;2.北京科技大学土木与环境工程学院,北京100083)

建立了高效液相色谱-电喷雾串联质谱(HPLC-ESIMS/MS)分析环境水样中22种抗生素类药物的方法。采用HLB固相萃取柱对环境水样中的目标化合物进行富集、净化,然后以6mL氨水-甲醇(5∶95,v/v)溶液洗脱。收集的洗脱液经氮气吹干至1mL,然后进行HPLC-ESIMS/MS分离分析。色谱流动相A相为甲醇-乙腈(1∶1,v/v),B相为0.3%(体积分数)甲酸水溶液(含0.1%(体积分数)甲酸铵,pH2.9);色谱柱为XTerra MS C18柱。质谱检测采用正离子扫描,多反应监测模式。分别以自来水和污水作为基质,22种抗生素类药物的加标平均回收率分别为54.9%～130%和57.4%～138%,相对标准偏差(n=3)分别为2.85%～28.6%和2.02%～23.2%;方法的检出限为0.05～0.5ng/L。将建立的方法应用于北京市高碑店湖和小清河水样的分析,结果表明在两个水样中均有部分抗生素类药物检出。

高效液相色谱-电喷雾串联质谱法;固相萃取;抗生素类药物;环境水样

Abstract:A method for the determination of22antibiotics in Environmental water samples was developed by using high perform anceliquid Chromatography-electrosp ray ionizationtandem mass spectrometry(HPLC-ESIMS/MS).The target antibiotics in water samples were enriched and cleaned-up by HLB solid-phase extraction(SPE)cartridges,and then eluted with6mL ammonium hydroxide-m ethanol(5∶95,V/V).The eluate was collected and concentrated to1 mL under a gentle stream of nitrogen gas,and then analyzed by HPLC-ESIMS/MS in positive electrospray ionization and multiple reaction monitoring(MRM)m ode.The separation was carried out on an XTerra MS C18column with mobile phases of A,m ethanol-acetonitrile(1∶1,v/v),and B,0.3%formic acid/water(containing0.1%ammonium form ate,V/V,pH2.9).The results show ed that the average recoveries of antibiotics in tap water and wastewater were54.9%-130%and57.4%-138%,respectively,and the corresponding relative standard deviations(RSD,n=3)were2.85%-28.6%and2.02%-23.2%,respectively.The method detection limits were0.05-0.5ng/L.The developed method was app lied to analyze the water samples of Gaobeidian Lake and Xiaoqinghe River in Beijing.The results show ed that some antibioticswere detected both in the two samples.

Key words:high performance liquid Chromatography-electrosp rayionizationtande mmass spectrometry(HPLC-ESI MS/MS);solid-phase extraction(SPE);antibiotics;Environmental water samples

抗生素(antibiotics)是指由细菌、霉菌或其他微生物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其他活性的一类物质。抗生素类药物主要应用于人和动物的疾病治疗,同时也以亚治疗剂量长期添加于动物饲料中,以预防疾病和促进动物生长[1]。目前广泛使用的抗生素类药物有喹诺酮类(quinolones,QN s)、四环素类(tetracyclines,TCs)、磺胺类(sulfonam ides,SAs)和大环内酯类(macrolides,MALs)等。人畜服用的抗生素类药物大多不能被充分吸收利用而随排泄物进入污水或直接排入环境。虽然许多抗生素的半衰期较短,但由于其被频繁地使用并进入环境,导致其形成“假持续”现象[2]。这已经成为水资源重复利用的一个巨大挑战,同时诱发了各类抗生素耐药细菌的产生,对人类健康和整个生态系统构成了长期潜在的威胁。

近年来,高效液相色谱技术,包括高效液相色谱-荧光法(HPLC-FLD)[3,4]、高效液相色谱-紫外检测法(HPLC-UV)[5-8]和高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)[9-17]等,已经成为抗生素类药物残留检测的首选技术。Ibá ñez等[18]采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱(U PLC-Q TO F MS)同时检测了地表水和污水中的42种抗生素类药物残留。目前国内对于环境水样中多种抗生素残留同时检测方法的报道还较少。

本文建立了采用HPLC-MS/MS同时检测环境水样中3类22种抗生素类药物的分析方法。采用固相萃取(SPE)技术对环境水样中样品进行富集和净化。该方法具有选择性强、灵敏度高、重现性好等优点,可满足各种环境水样中抗生素类药物残留检测的要求。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

U lt iM ate3000液相色谱仪,配有U lt iM ate3000自动进样器,P680二元梯度泵和Chromeleon6.70色谱工作站(美国D ionex公司);API3200三重四极杆串联质谱检测系统(美国应用生物系统公司),配有电喷雾离子源(ESI)和Analyst1.4.1工作软件;Oasis HLB SPE柱(6mL,200m g)(美国W aters公司);Votex涡旋混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司);M illi-Q超纯水仪(美国M illipore公司)。

甲醇和乙腈(色谱纯,美国Fisher公司),氨水(50%,体积分数)和甲酸铵(纯度为99%,美国A lfa Aesar公司),甲酸(纯度为98%,美国Fluka公司),乙二胺四乙酸二钠盐(N a2ED TA)(分析纯,国药集团化学试剂有限公司)。喹诺酮类抗生素药物标准品:氧氟沙星(ofloxacin,O FL,纯度为99.9%)、诺氟沙星(norfloxacin,NOR,纯度为99.9%)、环丙沙星(ciprofloxacin,C IP,纯度为99.9%)、沙拉沙星(sarafloxacinhydrochloride,SAR,纯度为95.0%)、氟罗沙星(fleroxacin,FLE,纯度为99.5%)、洛美沙星(lom efloxacin hydrochloride,LOM,纯度>98%)、双氟沙星(difloxacin hydrochloride,D IF,纯度为98.0%)、恩诺沙星(enrofloxacin,ENR,纯度为99.9%)(均购于美国Sigm a-A ldrich公司);大环内酯类抗生素药物标准品:红霉素(erythromycin A-dihydrate,ERY,纯度为99.1%)、罗红霉素(roxithrom ycin,ROX,纯度≥90%)、交沙霉素(josam ycin,JOS,纯度≥98%)、酒石酸泰乐菌素(tylosintartrate,TYL,纯度为82.4%)、螺旋霉素(sp iram ycin,SPI,纯度为88.9%)(均购于美国Sigm a-A ldrich公司);磺胺类抗生素药物标准品:磺胺嘧啶(sulfadiazine,SD Z,纯度为99.7%)、磺胺甲基嘧啶(sulfam erazin,SMR,纯度为99.9%)、磺胺间二甲氧嘧啶(sulfadim ethoxin,SDM,纯度为99.4%)、磺胺二甲基异恶唑(sulfisoxazole,SIA,纯度≥99.0%)、磺胺间甲氧嘧啶(sulfam onom ethoxine,SMM,纯度>98%)(均购于美国Sigm a-A ldrich公司),磺胺噻唑(sulfathiazole,ST,纯度>98%)、磺胺吡啶(sulfapyridine,SPD,纯度>98%)、磺胺甲基异恶唑(sulfa methoxazole,SMX,纯度>98%)(均购于日本东京化成工业株式会社),磺胺二甲基嘧啶(sulfamethazine,SDMD,纯度为99%)(购于美国Acros O rganics公司);替代物标准品:诺氟沙星-d5(norfloxacin-d5,NOR-d5,纯度为99%)(美国Sigm a-A ldrich公司),磺胺甲基异恶唑-d4(sulfam ethoxazole-d4,SMX-d4)、磺胺二甲基嘧啶-d4(sulfam ethazine-d4,SDMD-d4)、红霉素-13C,d3(erythrom ycin-13C,d3,ERY-13C,d3)(购于加拿大Toronto Research Chemicals公司)。

标准储备液和标准工作液的配制:分别称取10.0m g标准品,用甲醇溶解并定容于25mL棕色容量瓶中,配制成400m g/L的标准储备液,于-20℃下保存。取各标准储备液适量,用甲醇配制所需浓度的混合标准工作液,密封,于4℃下保存备用。

1.2 仪器条件

1.2.1 色谱条件

XTerra MS C18型色谱柱(2.1mm×100mm,3.5μm,美国W aters公司);流动相A:甲醇-乙腈(1∶1,v/v),流动相B:0.3%甲酸水溶液(含0.1%(体积分数)甲酸铵,pH2.9);流速:0.2mL/m in;梯度洗脱条件:0～2m in,10%A;2～12m in,10%A～70%A;12～16m in,70%A～100%A,保持3 m in;19～19.1m in,100%A～10%A;19.1～33 m in,10%A。进样量:15μL。

1.2.2 质谱条件

采用电喷雾离子源(ESI),分析物在正离子扫描下以多反应监测(MRM)模式分析。采用针泵进样,分别进行Q1和Q3扫描确定离子对,进而优化去簇电压(D P)等参数(见表1)。在选定的色谱条件下,接入流动相对离子源Gas1、Gas2和离子喷雾电压等参数进行优化,使信号稳定、灵敏度最高。优化的质谱分析条件:气帘气压力为0.14M Pa,碰撞气压力为0.02M Pa,离子喷雾电压为5 000V,温度为600℃,Gas1∶0.38M Pa;Gas2∶0.45M Pa。

表1 测定22种抗生素类药物和4种替代物的质谱条件Table1 Experimental conditions of electrosprayionization tandem mass spectrometry for the determination of22an tibiotics and 4 surrogates

表1 (续)Table1 (Con tinued)

1.3 样品前处理方法

环境水样经0.45μm滤膜过滤后,准确量取200mL,依次加入0.2g N a2ED TA,5ng NOR-d5,SDMD-d4,SMX-d4和20ng ERY-13C,d3,摇匀,然后用Oasis HLB SPE小柱(6mL,200m g)进行富集净化。上样前,HLB小柱依次用5mL甲醇和5 mL水进行活化;上样时,流速控制在1mL/m in左右;上样后,先用12mL水清洗HLB小柱,然后在负压下抽干,最后用6mL氨水-甲醇(5∶95,v/v)洗脱。洗脱液在35℃下用氮气吹干浓缩至1mL以下,最后用初始比例流动相定容至1mL,待测。

2 结果与讨论

2.1 SPE条件优化

2.1.1 SPE柱的选择

Oasis HLB固相萃取柱填充的是亲水亲脂平衡、水可浸润的反相吸附剂,是一种可适用于酸性、中性及碱性化合物的通用型萃取柱;Oasis WAX萃取柱填充的是混合型弱阴离子反相吸附剂,对强酸性化合物具有高的选择性。根据目标化合物的化学性质,考察了Oasis HLB柱和Oasis WAX柱的萃取效果。实验结果发现,HLB柱对目标化合物萃取效率较高,且该柱在干涸情况下不影响被测组分的回收率。因此,本文采用Oasis HLB固相萃取柱对样品进行富集和净化。

2.1.2 洗脱液的选择

分别采用甲醇和氨水-甲醇(5∶95,v/v)溶液为洗脱液进行试验。结果发现,采用氨水-甲醇溶液洗脱时,3类抗生素的回收率都在80%以上;采用甲醇洗脱时,尽管SAs类和MALs类抗生素的回收率在80%以上,但QN s类抗生素的回收率较低,为65%～80%。因此本文采用氨水-甲醇溶液进行洗脱。另外,分别考察了不同洗脱液用量(4,6,8和10mL)对抗生素回收率的影响。结果发现,当洗脱液用量大于或等于6mL时,22种抗生素可被完全洗脱,因此洗脱液用量确定为6mL。

2.1.3 水样pH值的选择

用甲酸和氨水将水样(去离子水)调至不同的pH值(pH2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0),考察其对抗生素回收率的影响。结果发现,当pH为4.0～8.0时,目标化合物的回收率较高。由于天然水样的pH值一般在pH4.0～8.0之间,因此本文不对实际水样的pH值进行调节,这与文献[11]中所报道的一致。

2.2 色谱条件的优化

流动相的pH值对抗生素的分离和保留具有重要的影响。在低pH条件下,22种抗生素都可实现良好分离。本文采用0.3%甲酸水溶液(含0.1%甲酸铵)缓冲体系来控制流动相B的pH值(pH 2.9),且甲酸有利于目标化合物的离子化,可得到较高的检测灵敏度。

分别考察了甲醇、乙腈、甲醇-乙腈(1∶1,v/v)体系作为流动相A对22种抗生素色谱行为的影响。结果表明,3种流动相体系都能得到尖锐对称的峰形,但甲醇-乙腈(1∶1,v/v)体系作为流动相时,质谱的响应值更高。因此本文采用甲醇-乙腈(1∶1,v/v)和0.3%甲酸水溶液(含0.1%甲酸铵)作为流动相,在流速为0.2mL/m in条件下,考察并最终确定了1.2.1节的梯度淋洗程序。如图1所示,其中图1a为22种抗生素混合标准溶液的色谱分离图,图1b～d分别为喹诺酮类、磺胺类和大环内酯类抗生素标准溶液的色谱分离图。

图1 (a)22种抗生素混合标准溶液、(b)8种喹诺酮类抗生素、(c)9种磺胺类抗生素和(d)5种大环内酯类抗生素混合溶液的色谱图Fig.1 Chromatograms of(a)a mixture solution of 22antibiotic standards,(b)8standard quinolones,(c)9standard sulfonamides and(d)5standard macrolides

2.3 线性范围和检出限

在选定的色谱和质谱条件下,对一系列质量浓度的混合标准溶液(替代物NOR-d5、SDMD-d4、SMX-d4的质量浓度固定为5μg/L,ERY-13C,d3固定为20μg/L)进行分析。以各分析物和替代物定量离子对的峰面积之比进行定量,得到的各分析物检测的线性范围和线性相关系数等参数见表2所示。结果表明,22种化合物均在较宽的范围内具有良好的线性,仪器的检出限(LOD)(信噪比为3)为0.01～0.1μg/L,因此方法对实际环境水样的检出限可以达到0.05～0.5ng/L。

表2 22种抗生素的线性回归方程、相关系数(r2)及检出限(LOD s,S/N=3)Table2 Regression equations,correlation coefficients(r2)and limits of detection(LOD s,S/N=3)of22an tibiotics

2.4 方法的精密度与准确度

分别在自来水和污水样品中进行加标回收实验,加标水平为25ng/L和500ng/L,按1.3节所述方法对样品进行处理,平行测定3份,考察方法的回收率和重现性。NOR-d5、SMX-d4、SDMD-d4和ERY-13C,d3作为替代物在富集之前与混合标准溶液一起加入到水样中。分析结果列于表3。从表3中可以看出:本文采用的前处理方法对22种抗生素具有良好的精密度与准确度。自来水中的加标回收率为54.9%～130%,相对标准偏差(RSD)为2.85%～28.6%;污水中的加标回收率为57.4%～138%,RSD为2.02%～23.2%。

表3 自来水和污水样品中22种抗生素的加标回收率和相对标准偏差(RSD)(n=3)Table3 Spiked recoveries and relative standard deviations(RSD s)of22antibiotics in tap water and waste water samples(n=3)

2.5 实际水样分析

采集北京市朝阳区高碑店湖和海淀区小清河表层水,采样时间为2009年12月11日。采用优化的SPE条件和HPLC-MS/MS分析条件,分别对高碑店湖水样(1#)和小清河水样(2#)进行分析,结果列于表4。研究结果表明,两个水样中均检出部分抗生素类药物,其中O FL、SD Z、SPD、SMX、ERY和ROX含量较高,最高为2#样品中SD Z的含量为715 ng/L。高碑店湖和小清河分别为高碑店污水处理厂和清河污水处理厂的受纳河体,这说明抗生素在污水处理过程中未被完全去除,从而进入水环境中。它们的迁移转化和生态效应值得进一步研究。

表4 环境水样中抗生素的含量Table4 Concentrations of22antibiotics in the environmental water samplesn g/L

3 结语

本文采用SPE与HPLC-MS/MS联用技术建立了环境水样中22种抗生素类药物残留的分析方法。该方法具有较高的灵敏度和选择性。将其应用于北京市高碑店湖和小清河水样中抗生素类药物残留分析,两个水样中均可检出抗生素类药物残留,其中以磺胺嘧啶含量最高。

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Determination of 22 an tibiotics in environmental water samples using high performance liquid chromatography-electrosprayionization tandem mass spectrometry

GAO Lihong1,2,SHI Yali1,LI Wenhui1,LIU Jiem in2,CAI Yaqi1＊
(1.State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology,Research Center for Eco-Environmenta l Science,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100085,China;2.Civil and Environment Engineering School,University of Science and Technology Beijing,Beijing 100083,China)

O658

A

1000-8713(2010)05-0491-07

＊通讯联系人:蔡亚岐,博士,研究员,主要研究方向为环境化学.Tel:(010)62849239,E-m ail:caiyaqi@rcees.ac.cn.

国家自然科学基金重点项目(No.20837003)、国家自然科学基金重大项目(No.20890111)和国家“973”项目子课题(No.2009CB421605).

2010-01-14

DO I:10.3724/SP.J.1123.2010.00491