柳穿鱼黄酮类成分的提取工艺优化

兰洲，田铁辉，关红峰，华会明，刘晓秋*

（1.沈阳药科大学中药学院，辽宁 沈阳 110016；2.沈阳药科大学高职学院，辽宁 沈阳 110032）

柳穿鱼黄酮类成分的提取工艺优化

兰洲1，田铁辉2，关红峰1，华会明1，刘晓秋1*

（1.沈阳药科大学中药学院，辽宁 沈阳 110016；2.沈阳药科大学高职学院，辽宁 沈阳 110032）

目的：优化柳穿鱼中黄酮类成分的提取工艺。方法：采用正交试验方法，以分光光度法测定总黄酮的含量和HPLC法测定柳穿鱼苷的含量为指标，确定柳穿鱼中黄酮类成分的提取工艺。结果：最佳提取工艺为80%乙醇8倍量，回流提取2次，每次1 h。结论：此提取工艺合理可行，为柳穿鱼的进一步研究提供参考。

柳穿鱼；黄酮；提取工艺；分光光度法；HPLC

柳穿鱼为玄参科（Scrophlariaceae）植物柳穿鱼Linaria vulgarissubsp.sinensis（Bebeaux）Hong的干燥全草。具有清热解毒，散瘀消肿之功效。该植物的化学成分有黄酮类［1］、环烯醚萜苷类［2］、生物碱类［3］、三萜类［4］等。民间主要用于黄疸、头痛、头晕、痔疮便秘、皮肤病和烫伤［5］。其主要成分为黄酮类化合物，具有抗炎、降血压、抗癌、镇痛等多种药理活性［6-9］。黄酮类成分中含有柳穿鱼苷、蒙花苷、乙酰蒙花苷、柳穿鱼苷元、刺槐素、木犀草素、香叶木素、白杨素［1］，其中柳穿鱼苷为黄酮类的主要成分［10-12］。目前，尚没有关于柳穿鱼黄酮提取工艺的报道，本文以HPLC测定柳穿鱼苷的含量和分光光度法测定总黄酮的含量为指标，通过正交设计优选黄酮类成分的提取工艺，为柳穿鱼的开发和合理利用提供依据。

1 仪器与材料

UV-2100紫外分光光度计（日本岛津公司），RE5-CS旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司），高效液相色谱仪（LC-10Atvp泵、DAD检测器、CLASS-VP工作站，日本Shimadzu公司）。Diamonsil ODSC18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm，北京迪马科技公司）。

柳穿鱼药材于2008年9月采自哈尔滨江北郊区，经内蒙古医学院乔俊缠教授鉴定为柳穿鱼Linaria vulgarissubsp.sinensis（Bebeaux）Hong的干燥全草。柳穿鱼苷（本实验室自制，纯度为99.2%）。柳穿鱼苷对照品（纯度质量分数＞98%，自制），乙腈（色谱纯，天津康科德科技有限公司），甲醇（色谱纯，天津康科德科技有限公司），纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司），其他试剂（分析纯，市售）。

2 方法与结果

2.1 分光光度法测定总黄酮的含量

2.1.1 对照品溶液的制备 取柳穿鱼苷对照品约5 mg，精密称定。加80%乙醇制成每1 mL含0.212 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取药材约0.5 g，精密称定，置50 mL量瓶中，用80%乙醇稀释至刻度，精密吸取上清液1mL，置25mL量瓶中，用80%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.3 测定波长的选择 精密量取供试品溶液和对照品溶液适量，在200～400 nm对供试品溶液和对照品溶液扫描，供试品和对照品均在330 nm处有最大吸收，故确定330 nm为测定波长。

2.1.4 标准曲线的绘制 分别精密吸取 “2.1.1”项下的柳穿鱼苷对照溶液 0.2，0.4，0.5，0.6，0.7 mL，加80%乙醇至10mL，摇匀，于330 nm波长处测定吸光度。以吸光度（A）为纵坐标，对照品量（X）为横坐标绘制标准曲线，得回归方程A＝4.450×10－2X＋8.500×10－3，r＝0.999 1（n＝5）。表明柳穿鱼苷在4.24～14.84μg·mL－1呈良好的线性关系。

2.1.5 精密度试验 取同一批药材约0.5 g，精密称定，按 “2.1.2”制备供试品溶液。取溶液分别在330 nm波长处重复测定5次，测得5次吸光度平均值为0.306，RSD＝1.0%。表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 取 “2.1.5精密度试验”项下的供试品溶液，在0，2，4，8，12 h测定吸光度，测得5次吸光度平均值为0.309，RSD＝1.5%，表明样品溶液在12 h内基本稳定。

2.1.7 重复性试验 分别取同批药材6份，各约0.5 g，精密称定，按 “2.1.2”制备供试品溶液。取溶液分别在330 nm波长处测定吸光度，计算总黄酮的含量，测得平均含量为2.8%，RSD＝2.6%。表明重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验 取已知含量的1号药材粉末约0.25 g，精密称定，加入适量的柳穿鱼苷对照品约3.7 mg。按 “2.1.2”制备供试品溶液。取溶液在330 nm下测定吸光度，计算总黄酮含量，平均回收率为98.9%，RSD＝3.0%。

2.1.9 样品的测定 取3批药材适量，按照“2.1.2”制备供试品溶液，测定吸光度，根据回归方程计算药材中总黄酮的量，结果发现，总黄酮的含量分别为2.92%，2.91%，2.81%。

2.2 HPLC测定柳穿鱼苷的含量

2.2.1 供试品溶液的制备 取药材约0.5 g，精密称定，置50 mL量瓶中，加体积分数为80%的乙醇50 mL，加热回流30 min，滤过，取滤液10 mL，浓缩至5 mL，经0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.2.2 样品的测定 取 “2.2.1”项下供试品溶液，按照文献［13］所建立的HPLC方法，对柳穿鱼苷进行含量测定。结果表明，3批药材柳穿鱼苷的含量分别为1.52%，1.50%，1.45%。

2.3 正交试验因素水平的确定

根据单因素分析结果和实际情况，对提取时间（A）、提取次数（B）、溶剂倍量（C）及乙醇浓度（D）4个因素进行考察，每个因素选择3个水平，采用L9（34）正交表安排试验，以柳穿鱼中总黄酮和柳穿鱼苷含量为考察指标，因素水平安排见表1。

表1 柳穿鱼总黄酮提取工艺正交试验因素水平表

2.4 正交试验结果

按照 “2.1”项下及 “2.2”项下方法操作，以总黄酮和柳穿鱼苷含量为指标，计算结果及进一步的方差分析分别见表2和表3。

表2 正交试验结果

表3 方差分析表

由表2直观分析结果表明，以总黄酮成分含量为指标，各因素对指标成分的提取率的影响依次为B＞D＞A＞C，最佳工艺为A3B2C3D3；以柳穿鱼苷的含量为指标，各因素对指标成分的提取率的影响依次为D＞B＞A＞C，最佳工艺为A3B2C2D3。

由表3方差分析结果表明，B因素（提取次数）和D因素（乙醇浓度）对总黄酮提取率有影响（P＜0.1），对柳穿鱼苷的提取率则有显著性影响（P＜0.05）。而A因素（提取时间）和C因素（溶剂倍量）因素的影响不大，对于A因素，结合直观分析可选择A2（60 min）；对于C因素（溶剂倍量），从节约溶剂的角度考虑，可选择C2（8倍量）。最后确定工艺工艺为A2B2C2D3。

2.5 试验结果验证

取3份药材各约10 g，精密称定。按A2B2C2D3提取，即80%乙醇8倍量回流提取2次，每次1 h，测得的总黄酮与柳穿鱼苷量分别为23.8，9.2 g·kg－1；25.5，11.7 g·kg－1；24.6，10.5 g·kg－1；与预测值基本一致，结果表明该提取工艺较合理。

3 讨论

根据文献报道，柳穿鱼中主要的黄酮类成分为柳穿鱼苷、蒙花苷、乙酰蒙花苷、刺槐素和柳穿鱼苷元等，紫外最大吸收波长分别都在270 nm和330 nm附近，而其中环烯迷萜苷类、生物碱类和三萜类成分在此波长下均无紫外吸收，因此对总黄酮及柳穿鱼苷的测定均不产生干扰。

柳穿鱼中主要的黄酮类成分柳穿鱼苷、蒙花苷等在水、甲醇及乙醇中溶解性较差，而易溶于热甲醇和热乙醇中，因此采用加热回流提取法进行回流提取。

［1］华会明，孙军，李铣.柳穿鱼黄酮成分的研究［J］.中药材，1999，30（5）：332-334.

［2］Esposito P，ScarpatiM L.IridoidⅨ 10-O-β-glucosil-aucubia dallaLinaria vulgaris［J］.Gazz Chim Ital，1970，100：836-845.

［3］华会明，朴奉花，王素贤，等.柳穿鱼新生物碱的研究［J］.沈阳药科大学学报，1997，14（3）：219.

［4］华会明，侯柏玲，李文，等.柳穿鱼中三萜类化合物的研究［J］.中草药，2000，31（6）：409-412.

［5］江苏新医学院.中药大辞典（下册）［M］.上海：上海人民出版社，1977：1526.

［6］ Esther Del Olmo， Arturo San Feliciano.Chem ical Constituents of Linaria aucheri［J］.Turk JChem，2004，28：133-139.

［7］Hyun LIM，Kun Ho SON，Hyeun Wook CHANG，et al.Anti－inflammatory Activity of Pectolinarigenin and Pectolinarin Isolated fromCirsium chanroenicum［J］.Biol.Pharm.Bull，2008，31：2063-2067.

［8］Rosa Tundis，Brigitte Deguin，Monica R.Loizzo，et al.Potential antitumor agents：Flavones and their derivatives fromLinaria reflexaDesf［J］.Med.Chem.Lett，2005，15：4757-4760.

［9］Monica Rosa Loizzoa，Rosa Tundis，Federica Menichini，et al.Acetyl-cholinesterase Inhibition by Extracts and Isolated Flavones fromLinaria reflexaDesf.（Scrophulariaceae）［J］.Nat.Prod.Com，2007，2：759-763.

［10］VALDE’S B.Flavonoid pigments in flower and leaf of the genusLinaria（Scrophulariaceae）［J］.Phytochem，1970，9：1253-1260.

［11］Hua Huim ing，Cheng Maosheng，Li Xian，et al.A new phyrroloquinazoline alkaloid fromLinaria vulgaris［J］.Chem Pharm Bull，2002，50（10）：1393-1394.

［12］EMI IA I，NEDJALKA H，SIMEON S.Iridoid glucosides fromLinaria vulgaris［J］.Phtochem，1992，31（3）：1040-1041.

［13］关宏峰，刘晓秋，兰洲，等.HPLC法同时测定中药柳穿鱼中柳穿鱼苷和橙皮苷的含量［J］.沈阳药科大学学报，2009，26（2）：119-122.

Optimization of Extraction Process of Flavonoids from Linaria Vulgaris

Lan Zhou1，Tian Tiehui2，Guan Hongfeng1，Hua Huiming1，Liu Xiaoqiu1
（1.School of Traditional Chinese Materia Medica，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang Liaoning110016，China；2.Higher Vocational Technology College of Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang Liaoning110032，China）

Objective：To optimize the conditions for extraction of flavonids fromLinaria vulgaris.Methods：The extraction conditions were studied by the orthogonal design with the content of total flavonoids and pectolinarin as indexes.Results：The optimum conditions were as follows Adding 8 times amount of 80%（V∶V）ethanol，and extracting for two times，1 h each times.Conclusion：The optimized method is reasonable and feasible for flavonids fromLinaria vulgarisssp.sinensis，and can provide a reference for further research.

Linaria vulgaris；Flavonoids；Extraction process；Spectrophotometry；HPLC

*刘晓秋，E－mail：liuxiaoqiu3388＠tom.com

2010-05-18）