生物反硝化脱氮碳源上微生物的多样性

王小娇 席亚萍 张 明

华东师范大学资源与环境学院 （上海 200062）

生物反硝化脱氮碳源上微生物的多样性

王小娇 席亚萍 张 明

华东师范大学资源与环境学院 （上海 200062）

为了研究废弃农作物作为反硝化脱氮处理的新型碳源和生物膜载体中微生物的多样性及微生物的群落结构，将玉米芯作为反硝化碳源和生物膜的载体布置在河道中，采集同步脱氮过程中的玉米芯样品并提取微生物总DNA，使用细菌通用引物对（GC341F和518R）从总DNA中成功扩增出目标16SrDNA片段，然后对扩增的16SrDNA进行变性梯度凝胶电泳（DGGE）测定，对凝胶染色并进行条带统计分析和切胶测序。结果表明以玉米芯为载体的生物膜优势菌变化规律与生存环境的变化存在较好的相关性，当水体中溶解氧提高后，生物膜上的优势种群以好氧/兼氧的异养杆状细菌Bacillus为主。

16SrDNA PCR DGGE

0 引言

由于城市化进程的加快和工农业生产的迅猛发展，氮、磷等营养元素通过多种途径汇入河流等水体，造成水体污染和富营养化问题日益突出。我国南方河流普遍存在低碳高氮现象，水体磷氮比过低使河流自净过程中反硝化所需的碳源不足，导致硝态氮难以有效去除。

本测试基于生物硝化-反硝化原理，研究了在模拟河道中提高水体中的碳浓度，营造反硝化环境，这种好氧、兼氧的生物膜环境为脱氮提供了良好的环境。尽管很多研究者对脱氮的工艺条件进行了大量研究，但是对其脱氮的微生物机理尚不清楚，现代分子生物学为深入研究环境中微生物提供了先进的技术手段。

通过从模拟河道装置中提取总DNA，并进行聚合酶链式反应（PCR）和变性梯度凝胶（DGGE）和DNA测序等新的分子生物学技术，对生物膜中细菌多样性和微生物群落进行了研究，以获得生物膜中细菌组成和动态变化规律。

1 材料和方法

1.1 样品的采集

待模拟河道装置开始运行后，分别选取不同的时间点，采集载体玉米芯上的生物膜，具体采样时间及装置的运行状态见表1。

表1 采样点时间及运行状态表

1.2 总DNA的提取

将从反应器中采集的玉米芯样品切割成2 cm大小，放入经灭菌处理的含100 mL磷酸盐缓冲溶液和玻璃珠（直径3～4 mm）的三角烧瓶中，漩涡振荡60 min，将玉米芯表面生物膜充分剥离，取含生物膜的液体部分10 000 r/min离心8 min，弃去上清液，沉淀部分即为含玉米芯表面生物膜的样品。

离心沉淀的生物膜样品采用进口的FastDNA SPIN Kit for Soi（lQ-biogene,CA,USA)试剂盒进行总DNA的抽提和纯化。过程如下：取300 μL生物膜样品加入122 μL的MT缓冲液，用珠磨器（Mini Beadbeater，USA）震荡破碎样品40 s；将离心管中的样品在12 000 r/min下离心30 s；将上清液转移到另一个干净的离心管中，加入250 μL PPS溶液，用手震荡混匀10次；在12 000 r/min下将离心管中混匀的样品离心5 min，将上清液转移到15 mL的干净离心管中；在15 mL离心管中加入1 mL吸附悬浮液；颠倒混匀离心管2 min，静置沉淀3 min；沉淀后移除500 μL上清液，将离心管中样品重新混匀，吸出600 μL混和液到试剂盒提供的Spin滤管中，在12 000 r/min下离心1 min；将剩余的混和液加入Spin滤管中离心；在Spin滤管中加入500 μL SEWS-M溶液，在12 000 r/min下离心1 min；弃去离心液，继续在12 000 r/min下离心2 min，以干燥剩余的SEWS-M溶液；将SpinTM滤管放入另一个干净的离心管中，在室温下放置干燥5 min；在SpinTM滤管中加入60 μL超纯水，手指轻弹管壁，在12 000 r/min下离心1 min,离心液即为提取的DNA样品。

采用紫外分光光度法对提取的总DNA进行定量测定。目前认为，在波长260 nm紫外线下，1OD（光密度数）的光密度相当于双链DNA浓度为50 μg/mL。采用微量石英比色皿中将提取的DNA样品稀释后测定A260的数值，则DNA浓度C（ng/μL）＝A260×稀释倍数/0.02。

1.3 PCR扩增

1.3.1 引物

根据文献，选用真细菌16SrDNA V3区通用扩增引物GC341F(5'CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGC GGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAG CAG 3')和518R(5'CGTATTACCGCGGCTGCTGG 3')，引物由上海生工公司合成。

1.3.2 扩增体系

PCR扩增体系为：Taq DNA聚合酶0.15 μL（5 U/μL），10倍反应缓冲液为3 μL，其中Mg2+为1.8 μL（25 mmol），dNTP（10 mmol）为3 μL，引物为0.5 μL（10 μmol PL），最后加灭菌的ddH2O至体积为30 μL。PCR试剂购自上海生工公司。

1.3.3 扩增程序

PCR反应在PCR仪（PTC-0200G、ALS-1244G、Bio-Rad，USA）上进行，反应过程为94℃变性5 min，然后94℃变性50 s，54℃退火50 s，72℃延伸2.5 min，循环29次，然后在72℃保持10 min。

1.3.4 PCR扩增检测

用1%琼脂糖凝胶电泳，核酸染料染色并拍照（Gel Doc XR凝胶成像系统，BIO-RAD，USA）。电泳检测时采用Marker DL2000（2 000、1 000、750、500、250、100 bp）作为分子量大小的标记。

1.3.5 DGGE分析

采用Dcode Universal Mutation System DGGE电泳系统（Bio-rad，USA）进行DGGE分析，10%聚丙烯酰胺凝胶，变性梯度35%～55%（100%变性剂含7 mol·L-1尿素和40%去离子甲酰胺），上样量为25 μL PCR产物，60℃、85 V恒定电压下电泳8 h。电泳结束后，凝胶用SYBR Green核酸染液染色30 min，于GelDoc 2000凝胶成像系统（Bio-Rad，USA）上成像检测并拍照。

1.3.6 测序

对聚丙烯酰胺凝胶上的目的条带在Gel Doc XR凝胶成像系统上（BIO-RAD，USA）进行切胶，回收的凝胶条带捣碎于30 μL无菌ddH2O中，放置过夜，让凝胶上的DNA溶解，而后进行PCR扩增，采用由上海生工合成的细菌16SrDNA通用引341F（5'CCTACGGGAGGCAGCAG 3'）和518R（5'CGTATTACCGCGGCTGCTGG 3）'进行PCR扩增。用于后续的DGGE.PCR扩增体系为：Taq DNA聚合酶0.15 μL（5 U/μL），10倍反应缓冲液为3 μL，其中Mg2+为1.8 μL（25 mmol），dNTP（10 mmol）为3 μL，引物为0.5 μL（10 μmol PL），最后加灭菌的ddH2O至体积为30 μL。PCR反应的程序同1.3.3。PCR产物送上海生工公司测序。

2 结果和分析

2.1 生物膜总DNA的提取

玉米芯生物膜样品总DNA的提取是采用PCR-DGGE技术进行分析的前提和关键步骤。DNA提取纯度影响后续的PCR扩增和多态性分析，提取的不完整性则会造成微生物种群多样性的流失。从7个玉米芯生物膜样品中提取的DNA通过1%的琼脂糖凝胶电泳检验（见图1）。

图1 玉米芯生物膜总DNA的提取

电泳结果显示，本研究采用的提取方法可以顺利提取出样品中的总DNA。

2.2 PCR产物

电泳检测结果见图2。

图2 PCR产物电泳检测图

由图2可知，用引物GC341F/518R对玉米芯生物膜总DNA样品扩增后的DNA片段大小约为220 bp，与相应16SrDNA上目的片断长度177 bp和GC夹（40 bp）长度之和相当，因此认为用引物341FGC/518R对玉米芯生物膜DNA的PCR实验结果可靠，可用于下一步DGGE分析。

2.3 PCR-DGGE-切胶测序

玉米芯生物膜总DNA的16SrDNA V3区片段DGGE指纹图谱见图3。

图3 玉米芯生物膜扩增的16SrDNA进行DGGE图谱

将玉米芯生物膜总DNA的16SrDNA V3区片段DGGE图谱中的主要优势条带进行DGGE切胶回收，采用PCR-DGGE凝胶电泳多次纯化后切胶，PCR扩增后送上海生工公司测序。

2.4 优势菌群16SrDNA片段测序（比对结果见表2）

表2 部分优势菌16SrDNA DGGE片断测序分析结果

表2 （续）

从表2可知，优势菌群主要包括Bacillus为好氧/兼氧的异养细菌，Clostridiaceae等均为兼氧/厌氧的异养细菌，体内均含有硝酸还原酶。这与这些玉米芯所处的生境均相吻合。

硝酸还原酶（nitrate reductase）可分为参与硝酸盐同化的同化型还原酶和催化以硝酸盐为活体氧化的最终电子受休的硝酸盐呼吸异化型（呼吸型）还原酶。同化型存在于高等植物、藻类、菌类及细菌，是由含Mo、黄素和正铁血红素的亚单位所成的酶，即分子内具有小的电子递体。菠菜、小球藻的酶其分子量约20万，作为电子供体，蓝藻为铁氧还蛋白，菌类主要为NADPH，而绿色植物主要为NADH，可由硝酸盐诱导，可被氨和有机氮的抑制。异化型酶存在于许多兼性好氧性细菌中，多为与膜结构结合的不溶性的，一般含铁及钼分子量数十万，似以细胞色素为电子供体，而专性嫌气性细菌产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）的酶是可溶性的，以铁氧还蛋白为电子供体。

3 结论

本测试所用的方法能成功地提取玉米芯载体上微生物DNA。以玉米芯为载体和碳源的生物膜上优势种的变化规律与装置的运行状况呈现较好的相关性：即当水体溶解氧水平较低时，生物膜上的优势种以兼氧/厌氧的Clostridium等反硝化异养菌为主，当水体中溶解氧水平提高后，生物膜上的优势种以好氧/兼氧的Bacillus等异养杆状细菌为主。好氧/兼氧的异养反硝化细菌的出现更好地为高溶解氧水平下模拟河道装置的反硝化脱氮提供了理论支持。

（略）

Q935

王小娇 女 1982年生 华东师范大学资源与环境学院环境科学系在读硕士 研究方向：环境微生物

2010年3月