中国北方沿海潮间带常见镜蛤的种类

刘泽浩, 李 捷, 杨学玲, 王海艳, 李永强, 张素萍, 徐凤山

（1. 青岛理工大学, 山东 青岛 266033; 2. 中国科学院 海洋研究所, 山东 青岛 266071; 3. 天津市宝坻区畜牧水产局, 天津 宝坻 301800）

中国北方沿海潮间带常见镜蛤的种类

刘泽浩1, 李 捷1, 杨学玲3, 王海艳2, 李永强1, 张素萍2, 徐凤山2

（1. 青岛理工大学, 山东 青岛 266033; 2. 中国科学院 海洋研究所, 山东 青岛 266071; 3. 天津市宝坻区畜牧水产局, 天津 宝坻 301800）

在形态学和分子生物学（28S rRNA、COI部分序列）分析的基础上, 对我国北方典型海区辽宁丹东, 山东烟台、威海, 江苏连云港的常见镜蛤进行了取样和分类地位的研究。结果表明: 日本镜蛤（Dosinia japonica）、薄片镜蛤（Dosinia corrugata）和饼干镜蛤（Dosinia biscocta）为我国北方沿海潮间带常见且大量分布的种类, 其中饼干镜蛤与日本镜蛤的遗传距离比较接近（以较高支持率聚为一支）。连云港的饼干镜蛤以及丹东的薄片镜蛤的不同个体间存在差异, 对这两地区的样品还有待作进一步的研究。

镜蛤（Dosinia）; 分类; COI; 28S rRNA

镜蛤属于软体动物门, 双壳纲, 帘蛤目, 帘蛤科,镜蛤亚科, 镜蛤属[1], 栖息于潮间带至潮下带浅海, 在中国南、北沿海均有分布, 可食用, 具有一定的经济价值。文献记载中国北方常见镜蛤有日本镜蛤（Dosinia japonica）、薄片镜蛤（Dosinia corrugata）、饼干镜蛤（Dosinia biscocta）、高镜蛤（Dosinia altior）、凸镜蛤（Dosinia derupta）[1～4]。由于镜蛤外壳形态相近, 通常以外套窦和小月面的形状为其主要分类特征, 种类鉴定困难。同物异名和异物同名现象比较严重。专家对于中国北方沿海镜蛤种类的报道有所不同: 庄启谦[2]和齐钟彦等[3]报道中国北方沿海的镜蛤种类有: 凸镜蛤（D. derupta）、日本镜蛤（D. japonica）、薄片镜蛤（D.corrugata）、饼干镜蛤（D. biscocta）、高镜蛤（D. altior）;徐凤山、张素萍记述中国北方海域的镜蛤种类有: 日本镜蛤（D. japonica）、饼干镜蛤（D. biscocta）、高镜蛤（D.altior）、薄片镜蛤（D. corrugata）[1]。

本研究对辽宁丹东, 山东烟台、威海, 江苏连云港 4个海区潮间带的镜蛤进行取样, 并对其形态特征和28S rRNA、线粒体COI部分序列进行分析, 认为目前中国北方沿海潮间带近海海域主要镜蛤种类有日本镜蛤（D. japonica）、薄片镜蛤（D. corrugata）和饼干镜蛤（D. biscocta）。

1 材料与方法

1.1 实验材料

研究用的镜蛤分别采自中国辽宁省的丹东、山东省的烟台和威海、江苏省的连云港 4个海区的潮间带（表 1, 图 1）。形态上初步鉴定为日本镜蛤（D.japonica）、薄片镜蛤（D. corrugata）、饼干镜蛤（D.biscocta）。样品采集后活体运回, 立即解剖, 取出闭壳肌、足、外套膜, 保存于96%的酒精中, 以备实验用。

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA提取

取30 mg保存于96%酒精中的样品闭壳肌组织,基因组 DNA的提取采用 TIANGEN海洋动物组织DNA提取试剂盒。获得的DNA样品用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测, 并将一部分模板稀释到 100 mg/L留作实验用, 其余未稀释的模板母液放于－20°C冰箱中备用[6～12]。

1.2.2 PCR扩增和测序

扩增反应在BIO-RAD公司生产的MyCyclerTM扩增仪上进行。用于28S rRNA片段扩增的引物为:28SD1F（5′-GGGACTACCCCCTGAATTTAAGCAT-3′）和 28SD6R（5′-CCAGCTATCCTGAGGGAAACTTCG-3′）[13]; 用于COI基因片段扩增的引物为: COIL1490（5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′）和 COIH-2198（5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′）[14]。50 μL 的 PCR 扩增体系为: 1.5mmol/L MgCl2;200 μmol/L dNTP; 0.2 μmol/L 引物; 100 ng 模板DNA; 2U Taq 酶; 5 μL 的 10×buffer[5]。扩增反应条件如下: 94°C 预变性 4 min; 94°C 变性 40 s,60°C（28S rRNA）/48°C（COI）退火 40 s, 72°C 延伸 1 min 15 s, 共 30 个循环; 最后 72°C 延伸 10 min[8～12]。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳进行检测。PCR产物由北京三博远志生物技术有限公司进行纯化回收、测序。

表1 取样地点、环境及测序样品数Tab. 1 Locations, habitats numbers of samples

图1 镜蛤取样地点的全国分布图Fig. 1 A map of China’s coast showing collecting sites ofDosiniaand related sites in our paper

1.2.3 序列分析

用BioEdit软件并结合DNA正反向序列图谱对DNA序列进行校正。用 Philip3.5软件用邻接法（neighbor-joining method, NJ）和最大简约法（maximal parsimony method, MP）建立系统发生树[5～12]。系统树做Bootstrap检验[5]。

2 实验结果

2.1 不同海区潮间带镜蛤形态分析

对采自不同海区的镜蛤进行形态分析, 发现不同地区镜蛤的形态有所差异。连云港赣榆地区镜蛤的外套窦有所差异, 有的个体外套窦窄且先端尖,有的个体外套窦宽且先端钝圆（图 2b）。威海与海阳地区镜蛤的形态差异较小。在本研究中丹东地区镜蛤的铰合齿、小月面存在形态差异（图2c, 图6）。

图2 不同海区潮间带镜蛤的形态特征Fig. 2 Morphological characteristics ofDosiniasfrom different intertidal areas

2.2 不同海区潮间带镜蛤的分子系统学分析

对镜蛤进行28S rRNA、COI序列测定, 测得单倍型用D. corrugate（DDC）、D. japonica（WH/HY）、D. corrugate（DDA）、D. corrugate（DDB）、D. biscocta（GYA）、D. biscocta（GYB）表示。

对本研究测得的每个单倍型和 Genbank中已登载的日本镜蛤（D. japonica,DQ343851）、青蛤（Cyclina sinensis,DQ343849）序列进行聚类分析,青蛤（C.sinensis,DQ343849）作为外群。所测得序列用Philip3.5软件分析, 用最大简约法（MP）和相邻法（NJ）进行聚类分析得到的 MP树和 NJ树表明（图3和图4）: 海阳地区（D. japonica（HY））、威海地区（D. japonica（WH））的镜蛤和 Genbank中登载的（D. japonica,DQ343851）聚为一支; 威海地区（D. corrugata（WH））、丹东地区（D. corrugata（DD））和赣榆地区（D. corrugata（GY））的镜蛤聚为一支。赣榆地区（D.biscocta（GYA）、D. biscocta（GYB））镜蛤聚为一支。

图3 根据28S rRNA部分序列数据构建的NJ树（A）和MP树（B）Fig. 3 Phylogenetic trees based on neighbour-joining（A）and maximal parsimony（B） analysis of partial 28S rRNA sequence using Kimura two-parameter distances with 1000 bootstrap

威海、丹东、赣榆地区镜蛤D. corrugate（WH/DD/GY）之间的遗传距离为 0～0.1%。威海、海阳地区镜蛤D. japonica（WH/HY）之间遗传距离为 0, 与Genbank登载的D. japonica（DQ343851）遗传距离为0.1%。赣榆地区镜蛤D. biscocta（GY）之间的遗传距离为 0.1%。D. japonica（WH/HY）与D. corrugata（WH/DD/GY）之间的遗传距离为 1.17%～1.27%,D. japonica（WH/HY）与D. biscocta（GY）之间的遗传距离为0.39%～0.49%,D. corrugata（WH/DD/GY）与D. biscocta（GY）之间的遗传距离为1.57%～1.79%（表2）。

D. corrugata（WH/DD/GY）之间的遗传距离为0～1.01%,D. biscocta（GY）之间的遗传距离为 0.17%,D. japonica（WH）、D. japonica（HY）之间的遗传距离为 0～0.17%。D. corrugata（WH/DD/GY）与D. biscocta（GY）的遗传距离为 16.78%～17.53%,D. corrugata（WH/DD/GY）与D. japonica（WH/HY）的遗传距离为 16.09%～16.94%,D. biscocta（GY）与D. japonica（WH/HY）的遗传距离为 12.00%～12.41%[5]（表3）。

图4 利用COI部分序列数据构建的NJ树（A）和MP树（B）Fig. 4 Phylogenetic trees based on neighbour-joining （A）and maximal parsimony （B） analysis of partial mtCOI sequences using Kimura two-parameter distances with 1000 bootstrap

3 讨论

3.1 中国北方沿海潮间带常见镜蛤的种类

文献记载中国北方沿海潮间带常见镜蛤有日本镜蛤（D. japonica）、薄片镜蛤（D. corrugata）、饼干镜蛤（D. biscocta）、高镜蛤（D. altior）[1～3]。凸镜蛤主要分布在中国各海区的近岸浅水区[1], 本研究未涉及凸镜蛤（D. derupta）的分类。本研究对辽宁丹东、山东烟台、威海、江苏连云港 4个海区潮间带常见镜蛤的形态和28S rRNA、线粒体COI部分序列进行分析, 认为中国北方沿海潮间带主要镜蛤种类有日本镜蛤（D. japonica）、薄片镜蛤（D. corrugata）、饼干镜蛤（D. biscocta）。分子系统树表明, 威海、海阳地区镜蛤D. japonica（WH）、D. japonica（HY）与 Genbank中登载的Dosinia japonica聚为一支, 遗传距离比较小, 为日本镜蛤; 丹东、赣榆地区镜蛤D. corrugata（DDA）、D. corrugata（DDB）、D. corrugata（DDC）、D. corrugata（GY）聚为一支, 形态与薄片镜蛤相似,为薄片镜蛤; 赣榆地区镜蛤D. biscocta（GYA）、D. biscocta（GYB）聚为一支, 形态与饼干镜蛤相似,为饼干镜蛤。分析表明饼干镜蛤（D. biscocta）和日本镜蛤（D. japonica）遗传距离比较小, 二者之间有较近的亲缘关系。本研究中未发现高镜蛤（D. altior）的样品, 至于高镜蛤在中国北方潮间带目前是否存在？其分类地位如何？这些还值得进一步研究。

表2 根据28S rRNA部分序列数据及Genbank登录D. japonica、C. sinensis序列构建的遗传距离Tab. 2 Pairwise sequence divergence for partial 28S rRNA fragments of tested samples and reference species,D. japonica and C. sinensis

表3 根据COI部分序列数据及Genbank登录Cyclina sinensis序列数据构建的Pairwise遗传距离Tab. 3 Pairwise sequence divergence for partial COI fragments of tested samples and reference species

3.2 中国北方沿海潮间带常见镜蛤的形态学分析

日本镜蛤为中国北方沿海潮间带常见种类[1～3]。本研究结果表明, 日本镜蛤（D. japonica（WH）、D. japonica（HY））不同个体间形态差异和分子差异比较小, 其中28S序列分析中只出现一个单倍型, COI序列分析中出现2个单倍型。

饼干镜蛤在所测样品的28S rRNA、COI序列中均出现两个单倍型D. biscocta（GYA）、D. biscocta（GYB）, 通过传统的形态学观察发现, 两个单倍型个体外套窦存在差异（图5）。有的个体外套窦窄且先端尖（图5A）, 有的个体外套窦宽且先端钝圆[2]（图5B）。

图5 赣榆饼干镜蛤两种不同单倍型个体的外套窦形态比较Fig. 5 Two different kinds of pallial sinus ofDosinia biscoctafrom Ganyu

庄启谦对薄片镜蛤进行了详尽的描述, 把薄片镜蛤分为Dosinia corrugate、Dosinia corrugate（Penicillata型）、Dosinia corrugate（Trailli型）和Dosinia corrugate（Hanleyaba型）几种不同的类型[2]。本研究发现薄片镜蛤的不同个体存在形态和基因序列的差异, 所测得的样品中28S rRNA出现两个单倍型, COI基因序列中出现3个单倍型。通过传统的形态学观察发现, 28S rRNA基因序列中的两个单倍型个体的壳宽存在差异, 小个体D. corrugate（DDA）（图 6 A）的壳宽反而大于大个体D. corrugata（DDB）（图6 B）的壳宽。而且两个体的小月面形状也存在差异（图6）,D. corrugata（DDB）的壳形在腹部中央偏后的部位略呈尖形[2], 符合对Dosinia corrugate（Penicillata型）的描述[2]。D. corrugata（DDA）（图6 A）的外套窦略宽, 弯入特别深, 斜伸至贝壳近前方,先端略尖, 和记载中对Dosinia corrugate、Dosinia corrugate（Penicillata型）、Dosinia corrugate（Trailli型）、Dosinia corrugate（Hanleyaba型）[2]的描述都有所不同。因此对于辽宁丹东海区的D. corrugata（DD）有待作进一步的研究。

图6 丹东薄片镜蛤的两个不同单倍型壳型和小月面形状比较Fig. 6 Two different haploid genotype ofDosinella corrugatafrom Dandong

3.3 两种不同聚类方法所得分子系统树的差异分析

鉴于本研究所涉及的镜蛤种类之间的碱基差异较小, 因此选择最大简约法（Maximum Parsimony methods, 简称 MP）和邻位相连法（Neighbor-joining,简称NJ）进行分析。最大简约法（MP）所得的进化树的拓扑形状是由序列上的每个碱基、氨基酸的状态决定的（一个序列上包含多个酶切位点, 而每个酶切位点的存在与否是由几个碱基的状态决定的, 也就是说一个序列碱基的状态决定着它的酶切位点状态,当多个序列进行进化树分析时, 进化树的拓扑形状也就由这些碱基的状态决定了）。邻位相连法（NJ）所得进化树拓扑结构的形成不同于 MP树, 不是由序列碱基、氨基酸状态决定的, 而是取决于两两序列的进化距离, 因此本研究中NJ树的拓扑结构与MP树拓扑结构存在较小差异。所得的两种不同分子系统树都进行了 Bootstrap检验。总体上, 两种聚类方法所得分子系统树的结果是一致的, 较真实地评估了中国北方沿海潮间带常见镜蛤（日本镜蛤Dosinia japonica、薄片镜蛤Dosinia corrugata、饼干镜蛤Dosinia biscocta）的进化关系。

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Received: May, 23, 2010

Key words:Dosinia; classification; COI; 28S rRNA

Abstract:To clarify the taxonomic status of commonDosiniafrom northern China, we collected and analyzed samples from four locations （Dandong, Yantai, Weihai, and Lianyungang） along north China’s coast using both morphological characters and DNA sequencing （nuclear 28S rRNA and mitochondrial COI sequence） data. The result suggests thatDosinia japonica, Dosinia corrugataandDosinia biscoctaare common species in intertidal areas of northern China, andD. biscoctaandD. japonicaare clustered closely. Morphology differences exist among individuals ofD. biscoctaof Lianyungang, as well asD. corrugataof Dandong. All of these samples need to be further investigated.

（本文编辑:梁德海）

Species of common Dosinia from intertidal zones of northern China

LIU Ze-hao1, LI Jie1, YANG Xue-ling3, WANG Hai-yan2, LI Yong-qiang1, ZHANG Su-ping2, XU Feng-shan2

（1. Qingdao Technological University, Qingdao 266033, China; 2. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China ; 3.Bureau of Animal Husbandry and Fisheries, Fianjin 301800, China）

Q959.1

A

1000-3096（2010）12-0030-06

2010-05-23;

2010-07-12

国家自然科学基金项目（40876084）; 海洋公益性行业科研专项经费项目（200805069）; 中国科学院海洋研究所知识创新前沿项目（2007-12）。

刘泽浩（1985-）, 男, 河北衡水人, 硕士, 研究方向: 海洋贝类分子系统分类, E-mail: adam004@163.com; 王海艳, 通信作者, 副研究员,研究方向: 海洋贝类分类及系统演化, E-mail: haiyanwang@ qdio.ac.cn