规模化猪场猪圆环病毒2型和副猪嗜血杆菌混合感染

鲁杏华，朱中武，谈志祥，何世成，范仲鑫，刘道新，邱立新

(1.湖南省动物疫病预防控制中心，湖南长沙410007；2.湖南出入境检验检疫局，湖南长沙410003)

2008年5月，湖南省湘南地区某年出栏生猪2万头左右的规模化养猪场发生较为严重的母猪死亡及繁殖障碍、仔猪发病率和死亡率均较高的猪传染病，经发病情况调查、临床症状、病理变化、实验室诊断，确定为猪圆环病毒 2型、副猪嗜血杆菌混合感染。

1 流行情况

该场饲养繁殖母猪400多头，存栏商品猪2 000多头，为了品种改良于2008年3月上旬从异地引入3月龄种猪60头，引入后28 d注射高致病性蓝耳病灭活疫苗，7 d后开始发病，并快速传染至原存栏仔猪和母猪。到4月底，共有发病仔猪376头，死亡282头；母猪发病34头，死亡18头。采用常用抗生素和中药制剂进行治疗，无明显疗效。

2 临床症状

发病生猪精神倦怠，反应迟钝，被毛粗乱，体温升高至40℃～42℃，食欲减少或废绝；体表皮肤出现紫斑，有些病例出现皮肤苍白、局部发绀；结膜潮红，呼吸困难，咳嗽，少数病例张口呼吸，呈犬坐姿势，有些病例出现明显的颤抖、关节肿胀、跛行、共济失调、活动量减少等症状，随后出现死亡；病猪体质消瘦，仔猪病程约10～30 d。感染母猪流产或产弱仔等繁殖障碍症状，公猪出现跛行，繁殖性能降低，其中18头母猪于高热、食欲不振或废绝4 d后因严重的呼吸障碍治疗无效死亡，死亡前四肢划动呈游泳姿势[1-2]。

3 病理变化

眼观可见：四肢、下腹、耳尖、会阴等末梢部位皮肤发绀，可视黏膜苍白或黄染；剖检眼观病变可见腹膜、心包膜、胸膜等浆液性和纤维素性渗出，渗出物置空气中呈胶冻状，肺实质性病变，病程较长的病例肺表面有大量纤维素性渗出，有些病例出现胸腔与胸壁粘连；肝肿大，表面有黄白色纤维素性渗出物；脾脏表面覆盖有纤维素性渗出物；肾肿大，有多量白色斑块；全身淋巴结肿大。肿大关节内有多量关节积液。

组织学病变主要特点是纤维素化脓性炎症，肺泡腔缩小，腔内可见少量的红细胞，肺泡间质增宽，间质中充满有大量的红细胞、嗜中性粒细胞、少量的淋巴细胞、单核细胞以及白细胞碎片；肝索紊乱，肝细胞颗粒变性或水泡变性，部分细胞出现核皱缩、破裂或溶解，肝窦变宽，可见较多嗜中性粒细胞、少量淋巴细胞和单核细胞浸润[1-2，5]。

4 实验室诊断

4.1 细菌学检验

4.1.1 细菌分离 用一次性注射器无菌采取猪肺、肝、脾、肺表面纤维素性渗出物、关节液，接种于巧克力平板培养基，37℃培养36～48 h后，巧克力平板内均生长灰白色、光滑、透明的小菌落。该菌在普通鲜血琼脂平板、普通营养琼脂内不生长，革兰染色为阴性细小杆菌，具有多种不同的形态。再用巧克力琼脂对细菌进行纯化，取典型菌落进行生化鉴定[2-4]。

4.1.2 细菌生化鉴定 取经巧克力平板纯化的可疑菌落，进行烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)生长依赖试验、尿素酶试验、CAMP试验，结果表明该分离菌对NAD生物依赖，尿素酶试验阴性，不溶血、CAMP试验阴性，不发酵甘露醇、乳糖、木糖、L-阿拉伯糖，但能发酵葡萄糖、蔗糖和D-核糖。

4.1.3 分子生物学检测 参考Oliveira S等[6]的方法进行副猪嗜血杆菌PCR检测。将待检可疑菌落接种于胰蛋白胨大豆肉汤培养基，37℃培养18～36 h，取1 mL培养液于经灭菌处理的1.5 mL EP管，12 000 r/min离心5 min，沉淀悬浮于 100 μ L 灭菌水中，100℃水浴中煮5～10 min，然后迅速置于冰上冷却5 min，10 000 r/min离心2 min，上清即为PCR模板。使用 1对引物(上游：5′-GTG ATG AGG AAG GGT GGT GT-3′和 下游 ：5′-GGC T TC GTC ACC CTC TGT-3′)进行 PCR 扩增。反应体系 ：10 ×Taq Buffer 2.5 μ L ，2 μ mol/L dNTPs 2 μ L ，20 μ mol/L 上 、下游引物各 0.5 μ L ，Taq DNA聚合酶 0.5 μ L ，无菌水 15 μ L ，模板 4 μ L 。PCR 反应条件 ：95℃变性 5 min，94℃ 50 s、59℃ 1 min、72℃2 min，30个循环；72℃延伸 10 min。取 6 μ L PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳，可见预期大小的条带，即副猪嗜血杆菌检测为阳性，结果见图1。

图1 副猪嗜血杆菌分离株PCR产物电泳图

4.1.4 药敏试验 用纸片法对分离菌株进行药敏试验，结果显示该菌株对头孢噻肟、氨苄西林、庆大霉素、新霉素较敏感；对磺胺二甲嘧啶、环丙沙星、阿米卡星、红霉素、壮观霉素、泰妙菌素不敏感。

4.2 病毒学检验

4.2.1 DNA/RNA抽提 随机抽取病猪病理组织样品4份，采用QiaGen公司提供的DNA/RNA提取试剂盒提取病毒DNA或RNA。

4.2.2 猪瘟病毒实时荧光 RT-PCR检测 根据Promega公司提供的ONE-STEP qRT-PCR System配制反应体系，参照赵建军等[7]的方法制备引物和探针，使用提取样品的 RNA进行实时荧光RT-PCR检测。反应条件为：45℃15 min；94℃5 min；94℃30 s，58℃ 45 s，72℃ 30 s，40 个循环扩增，退火延伸时收集荧光。阳性对照扩增到明显的S曲线，Ct值为 29.6，被检样品均为阴性。

4.2.3 猪繁殖与呼吸综合征病毒检测 应用猪繁殖与呼吸综合征病毒(Nsp2 1594-1680变异株)RTPCR检测试剂盒(购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司)对被检样品RNA进行PRRSV变异株检测，检测结果均为阴性(见图2)。

图2 猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR产物电泳图

4.2.4 猪2型圆环病毒检测 采用本实验室建立的猪2型圆环病毒PCR检测方法对5份被检样品检测 PCV-2 ，使用 1 对引物(上游 ：5′-ACTCCGT TGTCCCTGAGAT-3′和 下 游 ：5′-TTACCGGCGCACT TCGGCAG-3′)对提取的 样品 DNA 进行PCR扩增。反应条件：95℃ 3 min；95℃ 1 min，58 ℃30 s，72℃1 min，30 个循环；72℃延伸10 min。检测结果为4份样品PCV-2阳性，1份样品PCV-2阴性，PCR凝胶电泳结果见图3。

图3 PCV-2 PCR产物电泳图

5 药物治疗

采用该场使用较少的庆大霉素、氟甲砚霉素、环丙沙星、恩诺沙星等抗生素进行治疗(按说明书中治疗剂量使用)，饲料中添加金霉素和泰乐菌素，饮水中添加口服补液盐并同时注射维生素C，两星期后该场疫情得到控制。

根据以上实验室检测结果，结合临床症状和病理学变化及临床治疗效果，诊断该病例是由猪圆环病毒2型和副猪嗜血杆菌混合感染而引起的猪传染病。

6 综合防制措施

6.1 隔离已感染病猪，及时淘汰失去经济价值的病猪，在进行病死猪尸体处理过程中严格遵守生物安全管理条例。

6.2 加强环境卫生消毒，对空闲圈舍采用清水冲洗、有效药物消毒、火焰消毒等消毒措施，消毒空闲3～7 d。舍内走廊过道每周用有效药物消毒1～2次。猪群视猪舍温度不同，每月对猪消毒1～2次。生产用具每批猪或在每月消毒1次。各栋舍、生产单元、场门口等人员出入处设消毒池。常用的消毒药物有火碱等。现场监测表明，火碱的消毒效果较好。但浓度需在4%以上。空闲猪舍可熏蒸消毒。对健康猪群加强管理，定期消毒，搞好通风换气，饲料内添加黄芪多糖和多种维生素，提高健康猪群的免疫力。密切关注猪群健康动态，对刚发病猪迅速隔离的同时注射干扰素，连用3 d。

6.3 加强引种管理，引种前对种猪场疫病情况进行系统全面了解，引种时逐头采集引入种猪血样对猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、胸膜肺炎放线杆菌等进行血清抗体检测，检测结果均为阴性者方可引入。种猪引入后隔离饲养45 d后方可混群。

6.4 保持卫生和适当通风，及时清理粪便等污物，降低因污物发酵和腐败产生的有害气体对猪呼吸系统的损害。在进行走廊和圈舍清扫时应尽量避免尘埃向空气中扩散。

[1] 斯特劳.猪病学[M].赵德明，张仲秋，沈建忠，等译.8版.北京：中国农业大学出版社，2000.

[2] 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所.动物传染病学[M].北京：中国农业出版社，1999.

[3] 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所.兽医微生物学[M].北京：中国农业出版社，1998.

[4] R E布坎南，N E吉本斯.伯杰细菌鉴定手册[M].中国科学院微生物研究所《伯杰细菌鉴定手册》翻译组，译.8版.北京：科学出版社，1984.

[5] 王平利，梁宏德，陈福伟，等.猪副猪嗜血杆菌感染的病理学观察[J].河南农业科学，2005(12)：82-84.

[6] Oliveira S，Galina L，PijoanC.Development of a PCR test to diagnose Haemophilus parasuis infections[J].J Vet Diag Invest，2001(13)：495-501.

[7] 赵建军，成丹，李娜，等.猪瘟病毒实时荧光定量RT-PCR的建立及其对人工感染猪体内猪瘟病毒的检测[J].畜牧兽医学报，2007，38(7)：685-693.