健脾解毒方治疗裸鼠胃癌及其诱导胃癌细胞凋亡的研究

吴 琼，王 炎，周利红，刘宁宁，孙 珏，范忠泽，李 琦

（上海中医药大学附属普陀医院肿瘤科，上海 200062）

胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率居恶性肿瘤的第2位，发病率居恶性肿瘤第4位［1］。在我国，胃癌的死亡率居恶性肿瘤首位，其发病率居恶性肿瘤第2位［2-3］，严重危害着人民的生命和健康。目前胃癌的治疗首选手术，但复发率高、5年生存率低［4］。中医中药、中西医结合治疗因其疗效确切、毒副作用较低凸显了重要意义［5］。本实验旨在研究健脾解毒方诱导胃癌细胞凋亡的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 4 w～6 w龄SPF级BALB/c裸小鼠60只，雌雄各半，体重18 g～22 g。由中科院上海药物研究所提供。

1.1.2 药物与试剂 人胃低分化腺癌MKN-45细胞株引自中国科学院上海细胞生物研究所，接种于含10%小牛血清的RPMI1640培养液（含青霉素、链霉素各 100 U/mL）中，37 ℃ 、5%CO2、饱和湿度培养箱中常规培养。经体外、体内传代，形成稳定的皮下移植瘤模型，体内第3代移植瘤为瘤种；健脾解毒方（由生黄芪、生白术、木香、野葡萄藤、半枝莲等组成），含生药26.6 g/支；替加氟，上海医药（集团）有限公司华联制药厂（批号：070405）。RPMI Medium1640培养基（Gibico 公司）；小牛血清（Gibico 公司）；胰蛋白酶（Sigma公司）；青霉素、链霉素 （华北制药有限公司）。 RNAiso （Takara 公司）；DEPC （Sigma 公司）；RNA逆转录试剂盒（Takara公司）；荧光定量PCR试剂盒（Takara公司）；DNA 原位末端标记（TUNEL）试剂盒；链霉菌抗生物素蛋白－过氧化酶（SP）免疫组化染色超敏试剂盒（福建迈新生物技术有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 造模 取对数生长期人胃癌细胞株MKN-45，将细胞消化后收集到离心管中，然后用磷酸缓冲液（PBS）制成浓度为1×107/mL的细胞悬液。按2×106个/0.2 mL的细胞数量接种到裸小鼠的右前肢的腋部皮下。经过7 d～10 d，待皮下肿瘤生长至直径约1 cm～1.2 cm左右，选择肿瘤生长旺盛且无破溃的荷瘤鼠作为供瘤鼠，剥离皮下肿瘤组织，取肿瘤边缘新鲜的肿瘤组织，剪碎至1 mm3大小的组织块，在超净台用20号套管针接种于裸小鼠背部右侧近前肢皮下［4］，传至第 3 代为模型。

1.2.2 分组与给药 肿瘤接种约10 d后，选择肿瘤直径达到5 mm左右、瘤体生长良好、无自发出血坏死、瘤周无感染病灶的荷瘤鼠48只为实验模型，将所选裸小鼠随机分为空白对照组、替加氟组、健脾解毒方组、联合用药组4组，每组12只。空白对照组灌胃生理盐水0.5 mL/d，替加氟组灌胃替加氟100 mg/（kg·2 d），健脾解毒方组灌胃健脾解毒汤 40 g/（Kg·d），联合用药组灌胃健脾解毒汤40 g/（Kg·d）和替加氟100 mg/（kg·2 d），共计 14 d。

1.2.3 抑瘤率和模型生存期的观察 给药14 d后，各组随机取裸鼠6只，脱颈处死，酒精浸泡30 s消毒后，迅速剥离瘤体，称取瘤重，计算肿瘤生长抑制率［7］。

自治疗结束次日起观察各组余下6只荷瘤鼠的生存天数，记录生存时间，并计算生命延长率［7］。

1.2.4 TUNEL染色法检测裸鼠人胃癌组织细胞凋亡指数 采用dUTP缺口末端标记技术 （terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-endlabeling，TUNEL，脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法）检测肿瘤组织细胞凋亡情况。以阳性对照片（替加氟组）为参照系，判断标准为避开坏死区细胞核有明显棕黄色为阳性细胞［7］。随机选10个高倍视野（×400），借助网格记数器，细胞数大于1 000个以上，计算TUNEL阳性标记指数（TUNEL labeling index，TUNEL-LI），即凋亡指数 AI［8］。

1.2.5 Q Real-time PCR方法测定Bcl-2、Bax基因的mRNA表达 取各组肿瘤组织抽提总RNA，实时荧光定量PCR技术检测Bcl-2、Bax基因的mRNA表达。 相对 mRNA表达=2-△Ct，△Ct值=靶基因 Ct值－GAPDH Ct值。

人GAPDH、Bcl-2、Bax上、下游引物和探针由上海闪晶生物公司设计并合成，其中5′端标记上报告荧光基团 FAM（6-carboxy-fluo-rescein-phosphoramidite），3′端标记上淬灭荧光基团 TAMRA（carboxy-tetramethyl-rhodamine）。结果见表1。

表1 GAPDH、Bcl-2、Bax探针引物序列

1.2.6 免疫组化技术测定Bcl-2、Bax蛋白的表达采用链霉菌抗生素蛋白－过氧化酶（S-P）免疫组化染色方法检测Bcl-2、Bax蛋白的表达。以已知阳性片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。计数采用双盲法。

采用图像分析仪，结果判断标准为在组织胞浆和 （或）胞膜出现棕黄色颗粒状物为Bcl-2阳性标志；胞浆内出现棕黄色颗粒状物为Bax阳性标志。每张切片于高倍镜下（×400）任选10个视野，细胞数大于1000个以上，随机观察10个高倍视野，阳性计数采用双盲法，以阳性率作为观察指标［9］。

1.3 统计学方法

用PEMS3.1医学统计软件进行数据处理，计量资料数据用（±s）表示，经方差齐性检验后，多组资料间的比较采用单因素方差分析法；组间两两比较用采用SNK-q检验（Student-Newman-Keuls法）；检验标准均以P<0.05为差异有显著性。

2 结 果

2.1 健脾解毒方对裸鼠胃癌的抑制作用

结果见图1、表2。

图1 给药后各组肿瘤大小比较

表2 治疗后各组肿瘤组织瘤体重量及抑瘤率比较

由表2可以看出，与空白对照组比较，健脾解毒方组能显著抑制瘤体生长 （P<0.01），抑瘤率为57.04%；联合用药组瘤体重量最小（P<0.01），其抑瘤率达到83.10%，优于替加氟组和健脾解毒方组（P<0.05，P<0.01），提示健脾解毒方能抑制裸鼠胃癌生长，联合用药有增效作用。

2.2 健脾解毒方对胃癌裸鼠生存期的影响

空白对照组荷瘤裸鼠生存期最长9 d，最短5 d，平均7.3 d；替加氟组荷瘤裸鼠生存期范围8 d～14 d，平均10 d，生命延长率为36.36%；健脾解毒方组荷瘤裸鼠生存期范围11 d～18 d，平均13.83 d，生命延长率为88.66%；联合用药组荷瘤裸鼠生存期最长，范围12 d～22 d，平均16.33 d，生命延长率为122.72%，提示健脾解毒方能够延长荷瘤裸鼠生存期，联合用药有增效作用。结果见表3。

表3 治疗后各组荷瘤裸鼠生存天数及生命延长率比较 （±s）

表3 治疗后各组荷瘤裸鼠生存天数及生命延长率比较 （±s）

注：与空白对照组比较，1）P<0.01

组别 n 生存期（d）生命延长率（%）生理盐水组 6 7.33±1.63 -替加氟组 6 10.00±2.28 36.36健脾解毒方组 6 13.83±2.481） 88.66联合用药组 6 16.33±3.931） 122.72

2.3 健脾解毒方对裸鼠胃癌细胞凋亡指数的影响

结果见表4、图2。

表4 治疗后各组肿瘤组织凋亡指数比较 （±s）

表4 治疗后各组肿瘤组织凋亡指数比较 （±s）

注：与空白对照组比较，1）P<0.01；与联合用药组比较，2）P<0.01

联合用药组 645.67±5.031）

图2 治疗后各组胃癌细胞凋亡情况（TUNEL×400倍）

由表4可以看出，与空白对照组比较，替加氟组、联合用药组和健脾解毒方组凋亡指数显著升高（P<0.01）。而联合用药组凋亡指数优于替加氟组和健脾解毒方组（P<0.01）。提示健脾解毒方能够诱导胃癌细胞凋亡，联合用药有增效作用。

2.4 健脾解毒方对Bcl-2、Bax mRNA表达的影响

荧光定量PCR结果显示，与空白对照组比较，健脾解毒方组Bcl-2 mRNA水平显著降低（P<0.01），Bax mRNA水平明显上调 （P<0.01），Bcl-2/Bax比值下降。结果见表5。

表5 健脾解毒方对Bcl-2、Bax mRNA表达的影响 （±s）

表5 健脾解毒方对Bcl-2、Bax mRNA表达的影响 （±s）

注：与空白对照组比较，1）P<0.01

健脾解毒方组 6 0.227±0.0381.332±0.0820.17

2.5 健脾解毒方对Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

Bcl-2表达主要在细胞浆或细胞膜，染色呈棕褐色或棕黄色颗粒。免疫组化结果显示，与空白对照组比较，健脾解毒方干预后Bcl-2表达明显下调，差异比较有统计学意义 （P<0.01）；Bax表达主要在细胞浆，染色呈棕褐色或棕黄色颗粒，与空白对照组比较，健脾解毒方干预后Bax表达明显上调，差异比较有统计学意义（P<0.01）；Bcl-2/Bax比值明显下降，与荧光定量PCR方法检测的mRNA表达趋势一致。结果见表 6，图 3、图 4。

表6 健脾解毒方对Bcl-2、Bax蛋白表达率的影响 （±s）

表6 健脾解毒方对Bcl-2、Bax蛋白表达率的影响 （±s）

注：与空白对照组比较，1）P<0.01

组别 n Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax空白对照组 6 9.50±2.86 7.51±2.27 3.322健脾解毒方组 6 5.06±1.661） 22.10±5.191） 0.229

图3 空白对照组和健脾解毒方组肿瘤组织Bcl-2蛋白表达情况（SP×400）

图4 空白对照组和健脾解毒方组肿瘤组织Bax蛋白表达情况（SP×400）

3 讨 论

本研究论证了健脾解毒方在体内具有一定的抗胃癌作用，抑制肿瘤组织的生长，延长荷瘤裸鼠的生存期，并且联合替加氟作用更强，提示健脾解毒方能为化疗药物增效、提高荷瘤裸鼠对化疗药物的耐受性。

健脾解毒方由生黄芪、生白术、木香、野葡萄藤、半枝莲等组成，应用于临床能够显著改善胃癌患者的生存质量，延长患者生存期［10-11］。胃癌的病变过程复杂多变，但其根本在于脾胃气虚。脾胃为后天之本，气血生化之源，在胃癌的治疗中，健脾和胃是根本。早在宋元期间成书的 《卫生宝鉴·卷十四》云：“养正积自除，……令真气实，胃气强，积自消矣”，将扶正固本放在其治疗的首位。本研究为益气健脾、理气解毒法抗癌提供了实验依据。

细胞凋亡（apoptosis）指的是在生理或某些病理条件下由基因控制的一种单个细胞温和死亡形式，其正常发生调控着机体正常的生理活动，对机体维持稳态和组织器官正常生理功能有重要意义［12］。研究发现，恶性肿瘤的发生也与细胞凋亡异常密切相关，是凋亡机制受到抑制不能正常清除异常细胞的结果［13］。因此，临床上抗癌药物、化疗、放疗等主要作用机制之一都是通过诱导肿瘤细胞凋亡来达到治疗目的。

本研究探讨了健脾解毒方在体内抗胃癌和延长荷瘤裸鼠生存期作用；诱导胃癌细胞凋亡的作用，提示健脾解毒方诱导裸鼠胃癌细胞凋亡可能是其抗胃癌的机制之一。

Bcl-2蛋白家族是目前研究比较多的凋亡相关蛋白。目前已经鉴定出的Bcl-2蛋白家族有20余种，根据它们在细胞凋亡中的作用可分为两类：一类是抗凋亡蛋白，包括 Bcl-2、Bcl-x1、Bcl-1 等；另一类是促凋亡蛋白，包括 Bax、Bak、Bid、Bad 等。它们的相互作用调节着细胞的凋亡或生存。其中，Bcl-2、Bax是该家族中较为重要的两个功能相反的蛋白。二者比值对于细胞接受凋亡信号刺激后存活与否起关键性作用。免疫组化和荧光定量PCR方法检测健脾解毒方干预后Bcl-2、Bax的蛋白和mRNA表达情况，结果趋势一致，Bcl-2表达下调、Bax表达上调、Bcl-2/Bax比值下调，提示健脾解毒方抗胃癌作用与其诱导胃癌细胞凋亡、调控Bcl-2、Bax表达有关。

［1］Brenner H，Rothenbacher D，Arndt V.Epidemiology of stomach cancer［J］.Methods Mol Biol，2009，472（2）：467-477.

［2］周岱翰.临床中医肿瘤学［M］.北京：人民卫生出版社，2003：159-166.

［3］张思维，陈万青，雷正龙，等.中国肿瘤登记处2004年恶性肿瘤发病资料分析［J］.中国肿瘤，2008，17（11）：909-912.

［4］李连勇，刘庆森.胃癌化疗方案研究及策略进展［J］.肿瘤防治研究，2006，33（7）：536-539.

［5］刘佛添.胃癌的中医药治疗进展［J］.淮海医药，2009，27（1）：87-89.

［6］曾晖，邹冰，谭慧珍，等.苦参碱联合5-FU抑制人胃癌裸鼠移植瘤的生长作用及机制 ［J］. 广州中医药大学学报，2006，23（2）：164-171.

［7］王炎，李琦，冯年平，等.丹参酮ⅡA纳米粒治疗小鼠肝癌及其对Cyclin E 表达的影响［J］.上海中医药杂志，2007，41（9）：74-77.

［8］李琦，王炎，范忠泽，等.丹参酮ⅡA及其纳米粒诱导肝癌细胞凋亡及对 p38MAPK、TGFβ1信号蛋白表达的影响［J］. 肿瘤，2008，28（1）：8-12.

［9］赵爱光，杨金坤，尤圣富，等.中药WCA对人胃癌细胞SGC27901体内作用基因的筛选与验证［J］. 中国中药杂志，2008，32（19）：2 036.

［10］许建华，李朝衡，朱美华，等.健脾解毒方口服液抗肿瘤作用研究［J］.中药药理与临床，2004，20（4）：42-44.

［11］许建华，范忠泽，孙珏，等.健脾解毒方治疗晚期胃肠癌及对外周血 MDRmRNA 的影响［J］.上海中医药杂志，2007，41（5）：40-42.

［12］Radovic′N，Cucic′S，Altarac S.Molecular aspects of apoptosis［J］.Acta Med Croatica，2008，62（3）：249-256.

［13］Tait J F.Imaging of apoptosis［J］.J Nucl Med，2008，49（10）：1 573-1 576.

［14］Call J A，Eckhardt S G，Camidge D R.Targeted manipulation of apoptosis in cancer treatment［J］.Lancet Oncol，2008，9（10）：1 002-1 011.