雌二醇对老年雌鼠内分泌免疫功能调节的影响实验研究

田 莉

(陕西省妇幼保健院辅助生殖中心,陕西西安,710003)

妇女在更年期,由于卵巢功能衰退,合成与分泌的雌激素、孕激素日趋减少,植物神经调节功能渐失平衡,免疫功能下降,各个器官、神经系统的衰老等引起人体一系列生理与心理的改变[1]。雌二醇是雌激素中生物活性最强的一种,可反映女性卵巢功能,雌二醇的分泌受垂体前叶分泌的促性腺激素激活,体内雌激素水平对下丘脑控制的促性腺激素的生成进行负反馈调节,影响内分泌系统的调节作用,导致免疫功能发生变化[2]。基于神经-内分泌-免疫网络理论,笔者探讨雌二醇对内分泌及免疫系统的调节作用,阐述其治疗更年期综合征的药理作用基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品及试剂:雌二醇购自苏瑞医药化工有限公司,生化试剂盒购自南京建成生物科技有限公司。

1.1.2 实验动物:SD大鼠,雌性,按清洁级标准饲养。

1.2 方法

1.2.1 动物分组和给药:取3月龄雌性SD大鼠10只设为青年对照组,15月龄雌性SD老年大鼠20只,分为空白对照组、雌二醇给药组,每组10只,分笼饲养。雌二醇组每天给药量为1 mg/kg(相当于临床成人每公斤体重剂量的5倍);空白对照组灌生理盐水,给药时间为3个月。各组大鼠于3个月后处死,取血清、脾脏按实验要求保存。

1.2.2 激素测定:检测大鼠血清雌二醇(E2)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)水平,采用RIA法测定。

1.2.3 T细胞亚群检测[3]:取脾脏组织置于生理盐水中,机械法制备细胞悬液2 mL,加淋巴细胞分离液2 mL,分离细胞,取单核粒细胞层,调整细胞浓度为 4×106个/mL。取 100 μ L悬液,加羊抗大鼠CD4-PE、CD8-FITC(Pharmingen公司生产)各20 μ L,避光,室温孵育 20 min,加2 mL PBS离心,弃去上清,500 μ L PBS液上流式细胞仪(美国BD公司生产FACS Calibur型)检测,激发波488 nm氩离子激光器,在560 nm条件下,经FL1、FL2通道以对数方式分别获取信号,信号的获取及分析在软件Cellquest支持下完成。

1.2.4 T淋巴细胞凋亡的检测[3]:取脾脏组织,迅速用70%乙醇固定,24 h后用pH 7.4的PBS洗去乙醇,机械法制成细胞悬液,离心滤液,弃去上清液,调整细胞浓度为4×106个/mL,取100 μ L悬液加浓度为 10 μ g/mL 的 RNA 酶 500 μ L,消化 RNA 30 min,再加 50 μ g/mL PI(Sigma 公司生产)500 μ L,避光,室温孵育20 min流式细胞仪检测,方法同上。

2 结 果

2.1 雌二醇对老年大鼠E2、FSH、LH水平的影响

如表1所示,与青年对照组比较,老年大鼠空白组E2水平显著下降,FSH、LH水平上升;而经雌二醇治疗后,E2水平上升,FSH、LH水平下降差异有显著性,比较接近青年对照组水平,说明雌二醇对内分泌失调具有一定的调节作用。

表1 各组大鼠血清E2、FSH、LH水平( ±s)

表1 各组大鼠血清E2、FSH、LH水平( ±s)

注:与青年对照组比较,＊P<0.05,＊＊P<0.01;与空白组比较,P<0.05,P<0.01

组别 n E2(ng/L)FSH(mIU/mL)LH(mIU/mL)青年对照组 10 28.10±0.85 2.37±0.48 2.41±0.51空白组 10 14.65±0.64＊＊ 17.43±3.17＊＊ 3.85±0.43＊雌二醇组 10 21.34±0.74 8.47±2.15 2.86±0.75

2.2 雌二醇对老年大鼠CD4+、CD8+及CD4+/CD8+比值的影响

如表2所示,青年对照组比较,老年大鼠空白组CD4+、CD4+/CD8+显著下降,CD8+上升;而雌二醇治疗后与空白对照比较,CD4+、CD4+/CD8+上升,CD8+下降差异有显著性,比较接近青年对照组水平。雌二醇可增加脾脏CD4+,使CD4+/CD8+升高调整已经异常的淋巴细胞亚群,延缓免疫功能衰老,以增强机体免疫功能。

2.3 雌二醇对老年大鼠脾脏T细胞凋亡率的影响

如表2所示,青年对照组比较,老年大鼠空白组T细胞凋亡率显著上升;而雌二醇治疗后与空白对照比较,T细胞凋亡率显著下降,差异有显著性意义,比较接近青年对照组水平。提示雌二醇可降低脾脏淋巴细胞的凋亡率,增强机体免疫功能。

表2 各组大鼠脾脏T细胞亚群及细胞凋亡( ±s)

表2 各组大鼠脾脏T细胞亚群及细胞凋亡( ±s)

注:与青年对照组比较,＊P<0.05,＊＊P<0.01;与空白组比较,P<0.05,P<0.01

组别 n CD4+(%)CD8+(%)CD4+/CD8+ T细胞凋亡率(%)青年对照组 10 64.18±2.43 18.75±3.91 3.71±0.82 12.56±0.98空白组 10 48.53±1.75＊＊ 35.61±3.24＊＊ 1.51±0.42＊ 25.61±0.74＊雌二醇组 10 53.65±3.61 28.51±1.78 1.95±0.31 20.54±1.58

3 讨 论

本课题着重探讨雌二醇对老年雌性大鼠内分泌的调节作用,考虑到大鼠的实际寿命和生育年限,选用15月龄作为雌性大鼠自然初老模型,与青年期大鼠比较,E2、FSH、LH、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值、T细胞凋亡率存在显著性差异。表明与青年这一时期大鼠的神经内分泌免疫功能方面存在着一定的紊乱,说明选用此阶段大鼠作为实验模型是可行的。

在衰老过程中,内分泌系统的老化表现最为突出,而雌激素分泌的减少又是其中最早最突出的变化之一[4-8]。本实验雌鼠初老期T细胞明显减少,E2水平下降,由于E2分泌的减少,解除了其对垂体的负反馈,从而导致了FSH水平的升高;最终导致免疫功下降,内分泌调节作用出现问题。雌二醇可以通过提高E2分泌量,反馈地抑制FSH的释放。机体衰老时,垂体.甲状腺轴也出现功能减退,由于L、T4水平下降,反馈性地引起垂体TSH的增加,由于下丘脑-垂体-脾脏系统互相影响,导致机体脾脏功能下降,T细胞凋亡率增加。雌二醇可以使初老雌性大鼠脾脏功能增强,异常的T细胞恢复,体现其免疫系统调节功能。其具体作用机理可能与雌二醇调节多种细胞因子的合成和分泌有关,如抑制在神经-免疫-内分泌网络中起重要介质作用的细胞因子(如IFN-γ、TNF-α、IL-1 等)的释放[9]。

雌激素作为一个重要激素伴随并影响着女性的一生,进入老年,卵巢功能衰竭,雌激素水平低落,可诱发许多疾病,绝经后骨质疏松症尤其明显,而雌二醇(E2)是雌激素中分泌最多,作用也最强的一种。绝经后E2明显减少,仅50%的E2对靶细胞起作用。Gray等在1987年首先在体外培养的成骨细胞上发现了雌激素受体(ER),雌激素可直接作用于成骨细胞。有实验证明:ER的表达依赖于雌激素的存在。切除卵巢的大鼠的ERmRNA表达水平明显降低,而给予雌激素治疗者,ERmRNA表达水平接近正常,这正是对骨质疏松症妇女应用雌激素替代疗法的基础。随着雌二醇研究机理的不断深入,将会出现更多的雌二醇现代药物制剂,为妇女更年期综合征的诊治带来福音。

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[3]吴素慧,孙静汾,郭述真.复方更年康对骨质疏松雌鼠内分泌免疫功能调节的影响实验研究[J].中国中西医结合杂志,2004,24(6):545.

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