枯草芽孢杆菌FM208849产果胶酶发酵条件的优化

翟 秋 梅，薛 卫 巍，薛 永 常，郑 来 久

（1.大连工业大学 生物与食品工程学院，辽宁 大连 116034；2.大连工业大学 纺织轻工学院，辽宁 大连 116034）

0 引言

近年来，果胶酶由于在食品加工、饲料加工、纺织、造纸、环境保护、诱导植物抗病等领域的广泛应用［1］而备受关注，果胶酶生产优化则是降低成本和提高生产效率的基础。果胶酶生产中良好的碳源既能够促进菌种生长又能够作为诱导物促进产酶，因此碳源的选择在产酶发酵中作用突出。张保国、李祖明等［2-3］将甜菜渣作为最适碳源与诱导物提高了产酶效率，兰颖辉等［4］利用橘皮粉作为碳源进行果胶酶产酶发酵也大大提高了产酶效率。本实验室从青海柴达木盆地沤制的罗布麻表皮中筛选到1株高效产果胶酶的菌株——枯草芽孢杆菌（BacillussubtilisFM208849），并将其应用于罗布麻的微生物脱胶，取得了良好的脱胶效果［5-6］。本实验立足碳源作用的本质，除了对氮源与无机盐进行优化外，还从碳源（菌种生长）和诱导物（诱导产酶）的比例上对产酶培养基进行优化，以期达到好的产酶效果；同时对产酶发酵液的果胶酶进行了初步分析。

1 材料与方法

1.1 菌 种

枯草芽孢杆菌（BacillussubtilisFM208849）由辽宁省发酵工程重点实验室与纺织工程重点实验室分离保存。

1.2 培养基

种子培养基：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，pH 7.0，121 ℃灭菌20min。

基础培养基：蔗糖10g/L，蛋白胨10g/L，磷酸氢二钾2g/L，磷酸二氢钾2g/L，pH 7.0，115 ℃灭菌20min。

1.3 产酶培养基优化

1.3.1 菌种生长优化

1.3.1.1 碳源优化

分别用10g/L 的葡萄糖、淀粉、玉米淀粉和果胶等量替代基础培养基中的蔗糖制备培养基。接种摇瓶培养若干小时，以不接种的培养基为空白对照，在600nm 下测OD值［7］以确定最佳碳源。

1.3.1.2 氮源优化

分别用10g/L的酵母浸出物、牛肉膏、尿素、硫酸铵、酵母浸出物+蛋白胨（质量比1∶1）、酵母浸出物+蛋白胨+硫酸铵（质量比2∶2∶1）及酵母浸出物+蛋白胨+尿素（质量比2∶2∶1）替代基础发酵液中10g/L 的蛋白胨。接种摇瓶培养若干小时，以不接种的培养基为空白对照，在600nm 下测OD 值以确定最佳氮源。

1.3.1.3 无机盐优化

分别用4g/L 的硫酸锰、硫酸镁、硫酸铁、氯化钠等量替代基础发酵液中的磷酸二氢钠（2g/L）+磷酸氢二钠（2g/L），以不加无机盐的为空白。采用摇瓶发酵培养，培养若干小时后测定发酵液的OD600值，以确定最佳无机盐。

1.3.1.4 C/N 优化

确定了培养基的最佳碳源和氮源后，进行碳氮比实验，碳源与氮源的质量比分别为：1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1。采用摇瓶发酵培养条件，培养若干小时后，以不接种的培养基为空白对照测定OD600值。

1.3.1.5 正交试验

根据单因素实验的结果，选取碳源质量浓度、氯化钠质量浓度及初始pH 值3个重要因素，选用3因素3水平L9（33）正交表进行实验，结果见表1。

1.3.2 产酶诱导物的优化

果胶既是诱导物又是碳源［8-10］，因此本实验从碳源果胶含量的角度上对产酶诱导物进行优化。在得到的最佳发酵培养基的基础上，葡萄糖与果胶的质量比按1∶3、2∶2、3∶1的比例分别进行实验，发酵24、48、72、96h，发酵后的粗酶液进行酶活测定［11-12］，得出葡萄糖与果胶最佳配比和最佳发酵时间。

表1 正交试验条件表Tab.1 Orthogonal experimental conditions

1.4 果胶酶初步分析

1.4.1 果胶酶最适pH 的测定

酶解反应分别在pH 为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5的缓冲液中进行，温度取45 ℃，测酶活，以最高酶活为100%绘制相对酶活曲线以确定最适pH。

1.4.2 果胶酶最适温度的测定

酶解反应分别在35、40、45、50、55℃下进行，pH 取9.5，测酶活，以最高酶活为100%绘制相对酶活曲线。

1.4.3 果胶酶的丙酮分级沉淀

利用0～16.7%、16.7%～28.6%、28.6%～37.5%、37.5%～44.4%、44.4%～50%、50%～54.5%、54.5%～58.3%、58.3%～61.5%、61.5%～64.3%、64.3%～66.7%的丙酮浓度梯度对粗酶液进行分级沉淀。

1.4.4 SDS-PAGE

利用SDS-PAGE 方法［3］测果胶酶的相对分子质量。

2 结果与分析

2.1 碳源优化

培养基中加入了不同碳源后，经摇瓶培养10.5h后，测其OD600nm值，所得数据如表2所示。

表2 碳源种类对菌体生长的影响Tab.2 Effect of different carbon sources on the growth of strain

在其他条件相同的情况下，以葡萄糖为碳源的培养基中的菌体生长最快，其次是淀粉和蔗糖。但以果胶和玉米淀粉作碳源的培养基，菌体生长速率明显下降，说明该枯草芽孢杆菌对单糖的利用能力高于淀粉、果胶等多糖，对可溶性淀粉的利用能力高于玉米淀粉。

2.2 氮源优化

培养基加入了不同氮源后，经摇瓶10.5h，测其OD600值，所得数据如表3所示。

表3 氮源种类对菌体生长的影响Tab.3 Effect of different nitrogen sources on the growth of strain

结果表明，由牛肉膏作为氮源的培养基OD600值明显高于其他氮源，而且无机氮源硫酸铵并不利于其生长。说明牛肉膏作为一种有机氮源含有丰富的营养物质，足够满足菌体的生长，因而菌体增殖最快，选取牛肉膏为最佳氮源。

2.3 无机盐优化

培养基中加入了不同无机盐后，经摇瓶培养10.5h后，测其OD600值，所得数据如表4所示。

表4 无机盐对菌体生长的影响Tab.4 Effect of different inorganic minerals on the growth of strain

由表4可见，培养基中加入无机盐会促进菌体的生长，其中适量氯化钠对提高菌体的生长速率作用更为明显，但硫酸锰和硫酸铁会抑制菌体的生长。因此，在培养基中应加入适量氯化钠，以提高菌体的生长速率。

2.4 碳氮比实验

不同碳氮比的培养基经接种摇瓶培养7h后，测其OD600值，结果如表5所示。由表5可见，碳氮比1∶1 为最佳比例。正交试验中没有将C/N设为因素考虑。

表5 碳氮比对菌体生长的影响Tab.5 Effect of different carbon-nitrogen ratio on the growth of strain

2.5 正交试验

将碳源质量浓度、氯化钠质量浓度及初始pH 值3个因素进行L9（33）的正交试验，结果如表6所示。其中最优实验为第1次实验，即碳源与氮源的质量浓度分别为5g/L、氯化钠的质量浓度为2g/L、初始pH 7.0。

表6 L9（33）正交试验表Tab.6 L9（33）orthogonal experiment

由表7方差分析可知，三因素中氯化钠质量浓度和初始pH 对菌体生长影响显著。根据实验结果确定的最佳方案为A3B1C2，即枯草芽孢杆菌的最佳培养基配方为：葡萄糖与牛肉膏分别为5g/L、氯化钠2g/L，初始pH 8.0。

表7 正交试验方差分析Tab.7 Analysis of variance of orthogonal experiment

为了进一步验证所推论的最佳方案，实验又对最佳方案和正交试验中的最优方案进行了对比验证实验，结果如表8所示。表明预测最佳方案所测得OD600值高于正交试验中的最优试验，说明预测的结果最佳。为下一步诱导物优化奠定基础。

表8 正交试验验证表Tab.8 Verification of orthogonal experiment

2.6 诱导物优化

不同碳源配比、不同发酵时间下所测的酶活如表9所示。

表9 果胶与葡萄糖配比对菌体生长的影响Tab.9 Effect of different pectin-glucose ratio on the growth of strain

当m（果胶）∶m（葡萄糖）=1∶3时，产酶高峰出现在24h左右，而其他比例条件下的产酶高峰出现时间较长，因此m（果胶）∶m（葡萄糖）=1∶3时菌种能够在较短时间内大量产酶，最佳比例的确定不仅能够利于工业发酵产酶的碳源的选择，而且就麻类生物脱胶而言，可根据麻类韧皮中含有的糖类比例选择麻收割的时间和麻的品种，从而有利于生物脱胶的高效进行。

2.7 果胶酶最适pH 的测定

酶解反应分别在pH 7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5下进行15min后测酶活，以最高酶活为100%绘制相对酶活曲线如图1 所示，最适pH 为9.5。

图1 pH 对酶活的影响Fig.1 Effect of pH on the activity of the crude pectinase

2.8 果胶酶最适温度的测定

酶解反应分别在温度为35、40、45、50、55 ℃下进行15min后测酶活，以最高酶活为100%绘制相对酶活曲线如图2所示，最适温度为40 ℃。

图2 温度对酶活的影响Fig.2 Effect of temperature on the activity of the crude pectinase

2.9 丙酮分级沉淀

对发酵液进行丙酮分级沉淀并测酶活，选择丙酮浓度梯度分别为0～16.7%、16.7%～28.6%、28.6%～37.5%、37.5%～44.4%、44.4%～50%、50%～54.5%、54.5%～58.3%、58.3%～61.5%、61.5%～64.3%、64.3%～66.7%。果胶酶在不同梯度丙酮溶液中的分布结果如表10所示。

表10 不同丙酮梯度下的果胶酶活性Tab.10 Activity of crude pectinase on different acetone gradient

由表10可见，果胶酶在28.6%～37.5%的丙酮浓度梯度酶活最高，在44.4%～50%、61.5%～64.3%丙酮浓度梯度下酶活较低，因此实验选择28.6%～37.5%（2 泳道）、44.4%～50%（1泳道）、61.5%～64.3%（3泳道）3个丙酮浓度梯度等级进行电泳，如图3所示。2泳道有1条明显的带，且1、3泳道也有但浓度低于2泳道，与酶活测定结果相符。利用软件bandscan测出坐标进而初步计算出该果胶酶的分子质量在39.3ku左右。

图3 不同丙酮梯度下SDS-PAGE电泳图Fig.3 Electrophoretogram SDS-PAGE on different acetone gradient

3 结论

（1）从菌种生长和诱导物两个方面对Bacillus subtilisFM208849产酶培养基进行优化得到最佳培养基为：果胶与葡萄糖共4g/L（质量比为1∶3），牛肉膏15g/L，NaCl 2g/L，培养时间为24h。

（2）果胶与葡萄糖的比例大大影响了酶的产量和产酶速率。葡萄糖作为本脱胶菌种最佳碳源，既能促进菌种生长，但同时也能抑制果胶的利用，从而抑制果胶酶的产生。因此果胶与葡萄糖的比例对果胶酶生产而言非常重要。

（3）通过实验测得本实验用脱胶菌种所产果胶酶最适反应pH 为9.5，最适反应温度为40℃，并通过丙酮分级沉淀和SDS-PAGE 初步测得该果胶酶的分子质量在39.3ku左右。