松子壳多糖对小鼠主要免疫细胞功能的影响

刘中禄，吕铁钢，张永亮

(1.第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心，重庆 400042;2.华南农业大学，广州 510095)

松子壳多糖对小鼠主要免疫细胞功能的影响

刘中禄1，吕铁钢2，张永亮2

(1.第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心，重庆 400042;2.华南农业大学，广州 510095)

目的 探讨松子壳多糖(pine nut shell polysaccharide，PSP)对小鼠主要免疫细胞的影响。方法 应用MTT法测定PSP对小鼠脾淋巴细胞的毒性和对ConA或LPS诱生小鼠脾T、B淋巴细胞的转化，用中性红吞噬试验测定腹腔巨噬细胞的吞噬功能，应用乳酸脱氢酶释放法测定NK细胞的杀伤活性。结果 PSP对脾细胞毒性很低，各种浓度对小鼠脾淋巴细胞的增殖均有较强的促进作用(P＜0.01);PSP在浓度50～300 μg/mL时，明显促进T淋巴细胞的转化(P＜0.01)，但是当浓度达到300 μg/mL时表现出一定的抑制作用(P＞0.05);PSP在25～200 μg/mL时显著促进了小鼠脾B淋巴细胞的转化(P＜0.05)，但是当浓度达到300 μg/mL时，抑制作用极显著(P＜0.01);不同浓度均可以增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的能力及其代谢功能，当浓度在100 μg/mL时能显著的促进巨噬细胞吞噬中性红的能力(P＜0.01);PSP在浓度100～300 μg/mL时，能极显著的促进NK细胞对Yac－1的杀伤作用(P＜0.01)，当浓度达到400 μg/mL，对NK细胞杀伤性的促进作用开始减弱。结论 PSP对小鼠脾淋巴细胞的毒性较低，能增强免疫细胞活性，有望成为新一代免疫调节剂。

松子壳多糖;免疫细胞;免疫活性

多糖是来自高等植物，动物细胞膜，微生物的细胞壁中的天然大分子物质，已提取300多种，这些从天然产物中分离出来的多糖对抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂、愈溃疡、提高人体免疫力等方面都有非常显著的效果［1］。

松子壳多糖(pine nut shell polysaccharide，PSP)是从松子壳(松塔)中提取的酸性多糖成分，其在抗肿瘤、抗病毒和免疫促进剂作用［2－6］方面研究较多。本试验着重探讨松子壳多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖、巨噬细胞吞噬功能及NK细胞杀伤活性的影响，考察松子壳多糖对小鼠的免疫调节作用，旨在为新型免疫调节剂的研发奠定一定的实验基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级昆明小鼠20只，雌雄各半，体重18～22 g，购于第三军医大学实验动物中心［SCXK(渝)2007－0002］。

1.2 主要药品试剂

松子壳多糖(PSP)，由吉林大学农学部生化教研室提供［7］，以双蒸水配成10 mg/mL母液，临用时以含10%胎牛血清的RPMI－1640培养基稀释至所需浓度。

RPMI－1640培养基(美国 GIBCO公司);胰酶(Amersco公司);小牛血清(杭州四季青公司);四甲基偶氮唑盐(MTT)(Sigma公司)，以含10%小牛血清的RPMI－1640培养基配制，浓度为5 mg/mL;红细胞裂解液(Tris－NH4Cl，pH 7.4);吩臻二甲酯硫酸盐(PMS)(Biochemika公司);刀豆蛋白A(ConA)、脂多糖(LPS)、氧化型辅酶I(NAD)、左旋乳酸和碘硝基氯化四氮哩(INT)(Sigma公司);中性红生理盐水溶液，浓度为0.1%;分析纯二甲基亚砜(DMSO)(金山化工厂);细胞培养板(Coster公司)。Yac－1细胞系(吉林大学农学部免疫教研室惠赠)。

1.3 主要仪器

酶联免疫检测仪(BIO－RAD公司);CO2孵箱(美国SHELLAB公司);倒置显微镜(OLYMPUS公司);低温高速离心机(德国Heracus)。

1.4 方法

1.4.1 PSP对小鼠脾淋巴细胞体外转化的影响:在无菌条件下常规方法制备小鼠脾细胞，用含10%小牛血清的RPMI－1640(完全培液)调整细胞浓度为5×106/mL制成脾细胞悬液备用。

PSP对小鼠脾细胞的毒性试验:取上述脾细胞悬液，加入96孔细胞培养板，100 μL/孔。24 h后加入不同稀释浓度的PSP(终浓度分别为1000、500、200、100、50 和 25 μg/mL)，设 3 个复孔;对照组加入完全培液，置5%CO2孵箱中37℃培养48 h，培养结束前4 h，每孔加入MTT 20 μL，弃上清后每孔加DMSO100 μL，振荡 5 min，酶联免疫检测仪 570 nm下测A值，取3复孔均值。

PSP对ConA诱导的小鼠T淋巴细胞体外转化的测定:如上述脾细胞悬液，加入96孔细胞培养板，100 μL/孔。实验组及转化对照组每孔加入ConA10 μL(终浓度5 μg/mL)，空白对照孔加入等量完全培养液。实验组加入不同稀释浓度的PSP(终浓度分别为 400、300、200、100、50 和25 μg/mL)，设 3 个复孔;转化对照组加入完全培液。置5%CO2孵箱中，37℃培养48 h，按前述MTT法测定各A值，取3复孔均值。

PSP对LPS诱导的小鼠B淋巴细胞体外转化功能测定:方法同T淋巴细胞，只是丝裂原以终浓度20 μg/mL的 LPS代替 ConA。

1.4.2 PSP对小鼠巨噬细胞活性的影响:小鼠腹腔巨噬细胞悬液的制备:断颈处死小鼠后，75%乙醇消毒。剪开小鼠腹部外层皮肤，向其中注人无菌冷Hanks液5mL，轻揉小鼠腹部后用注射器将腹腔液抽出，置于无菌离心管中离心(1200 r/min，5 min)，沉淀弃上清，用完全培液制成2×106/mL的细胞悬液，将此细胞悬液加96孔培养板内，每孔100 μL，置5%CO2孵箱中37℃培养2 h。弃掉未贴壁细胞，再用10%NCS RPMI－1640洗涤细胞3次，剩下的贴壁细胞即为制备的巨噬细胞。

PSP对巨噬细胞代谢的影响:将巨噬细胞与不同浓度的PSP共同培养24 h后，每孔加入MTT20 μL(5 mg/mL)，37℃ 5%CO2培养 4 h后取出，弃上清后每孔加 DMSO100 μL，微量振荡器振荡5 min，酶联免疫检测仪570 nm下测A值，取3复孔均值。

PSP对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响:如上制备小鼠巨噬细胞，加入96孔细胞培养板内，每孔100 μL，含2×105个巨噬细胞。实验孔加入不同稀释浓度的 PSP，终浓度分别为 400 μg/mL、300 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL，每个浓度设3个复孔。对照组加入完全培液。置5%CO2孵箱中，37℃，饱和湿度连续培养24 h，然后每孔加入0.1%的中性红生理盐水溶液，每孔100 μL，继续培养 2 h。弃上清，加入 DMSO，100 μL/孔，震荡，酶联免疫检测仪570 nm下测 A值，取三复孔均值。

1.4.3 PSP对小鼠NK细胞活性的影响:将已调整好浓度的脾细胞悬液(即效应细胞)及Yac－1细胞悬液(即靶细胞)各取100 μL(效∶靶 =50∶1)加人96孔培养板中。实验孔加入不同稀释浓度的PSP(终浓度分别为 400、300、200、100、50 和 25 μg/mL)，设 3 个复孔，每孔 100 μL。以 0.5%BSA RPMI－1640为正常对照，同时设靶细胞自然释放孔(加100 μL 的0.5%BSA RPMI－1640)及最大释放孔(加 100 μL 1%NP－40)，混匀，置 5%CO2孵箱中，37℃，培养4 h。孵育结束后，将其置于4℃5 min终止反应，吸出100 μL的上清液于另一96孔板中，加人100 μL新鲜配制的底物LDH反应液充分混匀，反应15 min后，酶标仪570 nm处测各孔A值，按下式计算NK细胞活性:NK细胞活性(%)=(试验组A值－自然释放对照组A值)/(最大释放对照组A值－自然释放对照组A值)×100。

1.5 统计分析

采用SPSS10.0软件对数据统计，采用t检验，方差分析。

2 结果

2.1 PSP对小鼠脾细胞毒性实验

PSP对脾细胞毒性很低，对脾淋巴细胞增殖的促进作用随浓度增加变化不大，多糖浓度达到500 μg/mL，对脾淋巴细胞的增殖虽有促进作用，但和低剂量比较有所下降(表1)。

2.2 PSP对ConA诱导的小鼠T淋巴细胞体外转化的影响

各浓度的PSP能协同ConA诱导的小鼠T淋巴细胞体外转化。当浓度在50～200 μg/mL时，能明显的促进T淋巴细胞的转化，差异极显著 (P＜0.01);但是当浓度达到300 μg/mL时表现出一定的抑制作用(P＞0.05)(表2)。

2.3 PSP对LPS诱导的小鼠B淋巴细胞体外转化功的影响

与对照组比较，PSP在25～200 μg/mL时显著促进了小鼠脾B淋巴细胞的转化(P＜0.05)，但是随着浓度的继续升高，表现出较强的抑制作用，当浓度达到300 μg/mL时，抑制作用极显著(P＜0.01)(表3)。

表1 不同浓度PSP溶液对脾淋巴细胞的影响(A570)Tab.1 The effects of PSP on mouse splenic lymphocytes(A570)

表2 不同浓度PSP溶液对小鼠T淋巴细胞转化的影响(A570)Tab.2 Effect of PSP on proliferation of mouse T lymphocytes(A570)

表3 不同浓度PSP溶液对小鼠B淋巴细胞转化的影响(A570)Tab.3 Effect of PSP on proliferation of mouse B lymphocytes(A570)

2.4 PSP对巨噬细胞吞噬功能的影响

2.4.1 PSP对巨噬细胞代谢的影响:与对照组比较，PSP浓度在25～200 μg/mL时极显著增强了小鼠巨噬细胞的代谢功能 (P＜0.01)，但是随着浓度的继续升高，对巨噬细胞的代谢逐渐表现出抑制作用，当浓度达到400 μg/mL时抑制作用极显著(P＜0.01)(表4)。

表4 不同浓度PSP溶液对小鼠巨噬细胞代谢的影响(A570)Tab.4 Effect of PSP on macrophage metabolism in mice(A570)

2.4.2 PSP对小鼠巨噬细胞吞饮功能的影响:与对照组比较，PSP在25～300 μg/mL范围内，随浓度升高促进了巨噬细胞吞噬中性红的作用，浓度在100 μg/mL时促进作用极为显著(P＜0.01)，但是当浓度达到400 μg/mL时表现出一定的抑制作用，总体上PSP对巨噬细胞的活性影响呈双向剂量依赖关系(表5)。

表5 不同浓度PSP对小鼠巨噬细胞吞噬中性红的影响(A570)Tab.5 Effect of PSP on the activity of macrophages englobing neutral red in mice(A570)

2.5 PSP对小鼠NK细胞活性的影响

与对照组(自然释放组)比较，PSP在浓度100～300 μg/mL时，能极显著的促进NK细胞对Yac－1的杀伤作用(P＜0.01);在25～50 μg/mL时，能显著的促进NK细胞对Yac－1的杀伤作用(P＜0.05)，但浓度达到400 μg/mL，对NK细胞杀伤性的促进作用不明显(表6)。

表6 PSP对小鼠NK细胞杀伤活性的影响Tab.6 Effect of PSP on NK cell competence in mice

3 讨论

3.1 PSP对小鼠脾淋巴细胞体外转化的影响

脾脏是机体内最大的外周免疫器官，也是T/B淋巴细胞定居和接受抗原刺激产生免疫应答的重要场所，ConA等有丝分裂原能非特异性地诱导T细胞活化，LPS等有丝分裂原能非特异性地诱导B细胞活化，导致细胞因子合成及细胞因子受体表达。脾淋巴细胞转化实验是研究免疫调节剂对淋巴细胞作用的常用方法，也是反映机体细胞免疫最基本的指标，淋巴细胞的增殖和分化是机体免疫应答过程中的一个重要阶段，淋巴细胞受到抗原或促有丝分裂原刺激时增殖能力的强弱反应了淋巴细胞功能的高低。

淋巴细胞增殖反应既可通过形态学观察计数，也可用3H－TdR掺入法检测细胞内DNA合成量的增加，据此判断出淋巴细胞对有关刺激的反应性与功能状态。本实验采用MTT法检测PSP体外刺激对小鼠脾淋巴细胞转化的影响。MTT法的原理是活细胞特别是增殖细胞中存在线粒体水解酶可将MTT分解为兰紫色的结晶物质而显色，其光密度值能够反映细胞的增殖情况。

结果显示，PSP对淋巴细胞转化的影响呈现出低剂量促进、高剂量抑制的双向免疫调节作用，具体原因有待于进一步研究。PSP对淋巴细胞转化的这种强促进作用，为松子壳多糖的深入开发利用提供了一定的实验基础，因此继续探讨其免疫调节机制具有非常重要的意义。

3.2 PSP对巨噬细胞吞噬功能的影响

巨噬细胞是机体天然抵抗力的一种重要效应细胞，而且是一种具有多种功能的免疫细胞。激活的巨噬细胞可以参与特异性和非特异性免疫反应，有较强的吞噬和胞饮作用，巨噬细胞吞噬能力是衡量机体非特异性免疫功能的重要要指标之一。巨噬细胞的代谢状况和其吞噬能力直接相关，代谢旺盛，则说明巨噬细胞的吞噬能力增强;代谢减弱，则吞噬功能下降。实验结果表明，PSP浓度在25～200 μg/mL时极显著增强了小鼠巨噬细胞的代谢功能(P＜0.01)，但是随着浓度的继续升高，对巨噬细胞的代谢逐渐表现出抑制作用，当浓度达到400 μg/mL时抑制作用极显著(P＜0.01)。PSP在25～300 μg/mL范围内，随浓度升高促进了巨噬细胞吞噬中性红的作用，浓度在100 μg/mL时促进作用显著(P＜0.05)，但是当浓度达到400 μg/mL时表现出一定的抑制作用，总体上PSP对巨噬细胞的活性影响呈双向剂量依赖关系。

3.3 PSP对小鼠NK细胞活性的影响

NK细胞即自然杀伤细胞，是动物机体中除 T、B淋巴细胞外的又一类重要免疫细胞，不需抗原刺激，不需抗体参与，也不需补体协助，就可以直接杀伤靶细胞(肿瘤细胞)，主要在抗肿瘤的非特异性免疫过程中发挥作用。实验发现，PSP浓度在25～300 μg/mL时显著提高了NK细胞对Yac－1的杀伤作用，具有一定的浓度依赖性，随浓度升高，NK细胞免疫活性增强，但当 PSP浓度达到400 μg/mL以上，对NK细胞杀伤活性的促进作用开始减弱。上述结果的具体原因尚在研究之中。

3.4 其他

试验中还发现，PSP对脾细胞毒性很低，对脾淋巴细胞转化的促进作用随浓度增加变化不大。PSP对促进小鼠T淋巴细胞转化的效果要好于促进小鼠B淋巴细胞转化的效果，其具体原因还有待研究。以上实验均在体外进行，至于在体内是否具有相同的免疫调节作用，仍需建立相关体内模型进行验证。

4 结论

PSP对脾细胞毒性很低，在较低浓度时提高了ConA或LPS对小鼠脾T、B淋巴细胞增殖的促诱生作用，增强巨噬细胞的代谢功能，促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红作用和提高小鼠NK细胞对Yac－1的杀伤作用，高浓度却表现出一定的抑制作用。PSP对免疫细胞的活性影响呈双向剂量依赖关系。

［1］曹锦花，李华.多糖免疫调节作用的研究进展［J］.中国生化药物杂志，1999，2:22－27.

［2］Sakagami H，Kawazoe Y，Komatsu N，et al.Antitutmor，antiviral and immunopotentiating activities of pine cone extracts potential medicinal efficacy of natural and synthetic lignin－related materials(review)［J］.Anticancer Res，1999，11(2):881－888.

［3］Harada H，Sakagami H，Nagata K，et al.Possible involvement of lignin structurein anti－influenza virus activity［J］.Antiviral Res，1991，15(1):41－49.

［4］Lai PK，Donovan J，Takayama H，et al.Modification of human immunodeficiency viral replication by pine cone extracts［J］.AIDS Res Hum Retroviruses，199，6(2):205－217.

［5］吕永俊 ，王士贤 ，彭芳，等.松果有效成分研究－VI.红松与油松松塔及松子壳的抗癌活性［J］.大院学报 ，2008，7(2):1－2.

［6］侯芳玉，孙延波，盛学成，等.松子壳酸性多糖生物学作用的研究［J］.中草药，1995，26(4):193－196.

［7］张大伟，张永亮，昆道列提，等.红松松子壳酸性多糖最佳提取条件研究［J］.时珍国医国药，2006，17(6):997－999.

The Influence of Pine Nut Shell Polysaccharide on Immunological Function of Mouse

LIU Zhong－lu1，LV Tie－Gang2，ZHANG Yong－liang2
(1.Laboratory Animal Center，Institute of Surgery Research;Daping Hospital;Third Military Medical University;Chongqing 400042，China;2.College of Veterinary Medicine;South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China)

Objective To study the influence of pine nut shell polysaccharide(PSP)on mouse splenic lymphocytes.Methods Proliferation of T and B lymphocytes induced by ConA or LPS were determined by using MTT assay.Peritoneal macrophage function was determined by using neutral red approach.NK cell competence was determined by using lactate dehydrogenase approach.Results The results showed that PSP cell toxicity to splenic lymphocytes is very low，it remained higher immunologic competence on splenic lymphocytes even if the polysaccharide density achieves 1000 μg/mL.PSP of different concentrations can promote T and B Lymphocyte proliferation，and PSP significantly enhanced T lymphocyte proliferation induced by ConA ranging from 100 μg/mL to 300 μg/mL(P ＜ 0.01).Different density PSP could enhance the function of peritoneal macrophage englobing neutral red and its metabolism.PSP could improve effect of NK cells against YAC－1.Conclusions PSP has the immunity activeness strongly，the toxic low characteristic.Thus，this polysaccharide seems to be a good candidate for the development of immunity conditioner.

Pine nut shell polysaccharide(PSP);Immune cells;Immunologic competence

R392

A

1671－7856(2010)10－0033－05

10.3969/j.issn.1671.7856.2010.10.009

2010－06－21

国家自然科学基金30571355。

刘中禄，男，副教授。E－mail:lzl1432vip.sina.com

张永亮。E－mail:zhangyl@public.cc.jl.cn