表没食子儿茶素没食子酸酯对局灶性脑缺血－再灌注损伤的影响

段秀君

(河南省鹤壁市食品药品检验所，河南 鹤壁 458030)

表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)属于茶多酚中黄烷醇类，其基本结构为2-邻苯酚基苯并吡喃衍生物，具有很强的清除自由基、抗氧化功效[1-3]。关于EGCG是否能改善脑缺血-再灌注损伤时脑组织代谢障碍，尚未见报道。笔者采用线栓法建立大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血-再灌注损伤模型，并进行神经功能行为学评分、脑组织乳酸含量及能量代谢酶活性测定，旨在探讨EGCG对脑缺血-再灌注损伤的预防作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 试药、动物及仪器

药品与材料:EGCG(美国sigma公司，批号为E4143);乳酸检测试剂盒、三磷酸腺苷(ATP)酶检测试剂盒、考马斯亮兰蛋白定量试剂盒(南京建成生物工程研究所)。雄性SD大鼠，体重270～330 g，河南省实验动物中心提供，动物合格证号为410175。722型紫外分光光度计(上海第三分析仪器厂)。

1.2 实验设计

采用线栓致可逆性大鼠大脑中动脉阻断(middle cerebral artery occlusion，MCAO)方法造成局灶性脑缺血-再灌注损伤模型。选用雄性SD大鼠80只，随机分成5组，每组16只，即假手术组、缺血-再灌注模型组(I/R)、EGCG高剂量组(100 mg/kg)、EGCG中剂量组(50 mg/kg)、EGCG低剂量组(25 mg/kg)。术前60 min采用腹腔给药的方式，注射不同质量分数的EGCG溶液，假手术组和模型组则分别给予等量的生理盐水。

1.3 模型建立

用10%水合氯醛麻醉(300 mg/kg)大鼠，分离暴露出左侧颈总动脉(common carotid artery，CCA)、颈外动脉(external carotid artery，ECA)、颈内动脉(internal carotid artery，ICA)和翼腭动脉(Pterygopalatine artery，PPA)和迷走神经。依次游离并电凝右ECA的所有分支，结扎ECA的主干。分离ICA至颅底，在PPA的起始处结扎PPA，仅保留ICA入颅主干。将预先准备好的尼龙线(尼龙线头端烧成光滑的线拴，直径约为0.25 mm)经ECA主干的切口插入到大脑中动脉(middle cerebral artery，MCA)的起始处，大约离颈内、颈外静脉分叉处约18 mm，感到阻力时，即完成一侧MCA阻塞。缝合切口，将尼龙线的尾端留在皮外，再灌注时将尼龙线轻轻外抽，感到阻力时，意味着尼龙线的头端已回到ECA的主干中，从而实现MCA的再灌注。假手术组只进行麻醉和血管分离术，不结扎血管及导入线栓。

1.4 观察指标及方法

神经功能缺损评分:脑缺血1 h、再灌注24 h后，采用Longa等[4]的神经功能学评分法检测动物神经损伤程度。肢体活动正常记为0分;梗死对侧前爪内收、不能伸直记为1分;向偏瘫侧转圈者记为2分;自主运动时向偏瘫侧倾倒记为3分;无自主活动，并伴意识障碍记为4分。

脑组织含水量测定:进行神经功能评分后，将大鼠断头处死，取出右侧脑组织，用滤纸吸干表面水份，立即于电子天平称重(湿质量)，120℃恒温烘烤24 h至恒重后再次称重(干质量)，采用干湿质量法测定脑组织含水量，按Ellis公式[5]计算脑组织含水量。脑含水量=(湿质量-干质量)/湿质量×100%。

脑组织匀浆制备:将大鼠按时断头，取右侧脑组织，称取脑组织块约0.5 g，用预冷的生理盐水冲洗组织表面的血液，滤纸吸干，再次称重，置电动玻璃匀浆器中，加入预冷的生理盐水制成脑组织匀浆，再以4℃低温、3 000 r/min转速离心10 min，取上清液，贮存于-20℃冰箱保存，备用。

生化指标测定:按照试剂盒说明，以比色法测定乳酸的含量和Na+-K+-ATP酶的活性，以考马斯亮蓝法测定蛋白的含量。

1.5 数据处理

2 结果

结果见表1。可见大鼠脑缺血1 h再灌注24 h后，模型组神经功能缺损评分、脑组织含水量及脑组织乳酸含量明显升高，脑组织Na+-K+-ATP酶活性明显降低，与假手术组比较，差异具有显著性(P＜0.05);EGCG各剂量组神经功能缺损评分、脑组织含水量及脑组织乳酸含量明显降低，脑组织Na+-K+-ATP酶活性明显升高，与模型组比较，差异具有显著性(P＜0.05)。

表1 EGCG对大鼠脑缺血再灌注损伤神经功能评分及脑组织含水量的影响(X ±s，n=8)

3 讨论

EGCG的脂溶性高，能有效通过血脑屏障[6]，清除自由基，降低脂质过氧化[7-8]，从而具有神经保护作用。

由于脑的能量代谢具有对氧的需求量大、靠血液转运葡萄糖供能、没有糖原及ATP的储备等特性，所以当脑缺血时脑组织必须采用无氧酵解的方式代谢葡萄糖获得能量，而无氧酵解途径的能量产生有限，会出现能量耗竭，神经元处于能量低下状态，引起进一步继发病理状态，从而引起神经元的损伤和死亡[9]。在氧供不足的情况下，糖代谢产生的丙酮酸在乳酸脱氢酶的催化下生成乳酸，因此乳酸的水平反映了组织无氧酵解的程度。而脑组织中乳酸的蓄积也会进一步引起神经元的损伤，造成恶性循环。由于ATP酶直接以ATP为底物，其活性直接受到组织ATP水平的影响。脑缺血后ATP生成减少以及缺氧可导致缺血酸中毒，脑组织内酸性代谢产物增多，使得ATP酶活性降低，因此ATP酶活性可以反映细胞的能量水平。脑缺血-再灌注损伤后，能量耗竭，ATP产生不足，Na+-K+-ATP酶活性下降，导致细胞内Na+浓度增高引起细胞毒性脑水肿而影响细胞功能[10]，从而造成神经损伤。缺血-再灌注组大鼠的脑组织乳酸水平显著升高，ATP酶活性显著下降，这两方面的结果共同反映了缺血-再灌注损伤大鼠脑组织神经元氧供不足，能量代谢障碍。

本研究结果表明，EGCG能明显降低大鼠大脑中动脉缺血-再灌注损伤脑组织含水量和乳酸的生成，提高缺血脑组织的ATP酶活性，改善能量代谢障碍的状况，增加脑组织能量供应，减轻因能量耗竭引起的神经系统损害，从而对脑神经起到保护作用。

[1]Wei IH，Wu YC，Wen CY，et al.Green tea polyphenol(-)-epigallocatechin gallate attenuates the neuronal NADPH-d/nNOS expression in the nodose ganglion of acute hypoxic rats[J].Brain Res，2004 ，999:73-80.

[2]Büttemeyer R，Philipp AW，Schlenzka L，et al.Epigallocatechin gallate can significantly decrease free oxygen radicals in the reperfusion injury in vivo[J].Transplant Proc，2003，35:3 116-3 120.

[3]Etus V，Altug T ，Belce A ，et al.Green tea polyphenol(-)-epigallocatechin gallate prevents oxidative damage on periventricular white matter of infantile rats with hydrocephalus[J].Tohohu J Exp Med ，2003，200:203-209.

[4]Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rat[J].Stroke，1989，20:84-91.

[5]Wei J，Quast MJ.Effect of nitric oxide synthesis inhibitor on a hyperglycemia rat model of reversible Cal ischemia:detection of excitatory amino acids release and hydroxyl radical formation[J].Brain Res，1998，791(122):146-156.

[6]Suganuna M，Okabe S，Oniyama M，et al.Wide distribution of[3H](-)-epigallocatechin gallate，a cancer preventive tea polyphenol，in mouse tissue[J].Carcinogenesis，1998，19:1 771-1 776.

[7]胡秀芳，杨贤强.茶儿茶素对癌细胞凋亡作用的研究[J].茶叶科学，2001，21(1):26-29.

[8]Yoshioka H，Akai G，Yoshinage K.Protecting effect of a green tea percolate and its main constituents afainst gamma ray-induced scission of DNA[J].Biosci Biochem，1996，60:117-119.

[9]Keelan Bates TE，Clack JB.Heiglltened，resistance，of the neonatal brain to ischemia-repefusion involves a lack of mitochondrial damage in the nerve terminal[J].Brain Res，1999:124-133.

[10]Yung GY，Chen SF，Kinouchi H，et al.Edema cation Content and ATPase activity after middle cerebral artery occlusion in rats[J].Stroke，1992，23(9):1 331-1 336.