微珠芯片免疫法对肉制品中莱克多巴胺残留的检测*

胡 磊，左 鹏，叶邦策

（华东理工大学生物工程学院，上海200237）

微珠芯片免疫法对肉制品中莱克多巴胺残留的检测*

胡 磊，左 鹏，叶邦策

（华东理工大学生物工程学院，上海200237）

构建了一个基于功能化微珠表面竞争性免疫反应的流控芯片体系，在环氧化微珠表面固定小分子莱克多巴胺的蛋白全抗原，然后依次与一抗和携带荧光的二抗反应，最后输出荧光信号。在检测中，采用内标-标准曲线法，先利用标准品制作竞争性免疫反应的标准曲线，然后进行实际样本检测。该系统检测的莱克多巴胺的最低检测限达到0.03 μg/L，检测时间不超过45 min。

微珠芯片；环氧化；莱克多巴胺；兽药残留；最低检测限

莱克多巴胺（Ractopamine Hydrochloride，RA C），属β-肾上腺素兴奋剂（β-兴奋剂）类药物中的苯乙醇类衍生物，是通常所说的瘦肉精，具有显著提高胴体瘦肉率，改善动物饲料利用效率的生产性能。莱克多巴胺也能提高饲喂动物的瘦肉率，但因其危害大，我国已禁止使用[1]。畜禽饲喂莱克多巴胺对动物和人都会产生危害，对动物的危害表现在长期使用后易引发肌肉震颤，四肢和面部肌肉最明显，对人危害表现为人吃了残留有莱克多巴胺的组织后可能会出现中毒症状，通常表现为面色潮红、头晕、心悸、四肢麻木等不良反应，对有心血管病的患者危害更大，严重的危及生命，我国已严禁在饲料中添加使用[2]，并且世界各国都在积极开发检测莱克多巴胺的办法。

目前检测莱克多巴胺的方法主要有高效液相色谱法，毛细管电泳法，酶联免疫法等等，虽然检测方法多种多样，但普遍存在检测仪器昂贵，操作繁琐等缺点，为此采用了一种新的生物芯片法-微珠芯片法来进行检测分析。近年来，生物芯片作为一种新型的生物材料和实验方法得到了广泛的应用[3]，生物芯片有多种形式，包括微阵列芯片和微流控芯片，本文研究的是一种类似于微流控的微珠载体芯片，这种基于竞争免疫反应原理的微珠载体芯片测定方法具有灵敏度高、特异性强、通量高、试剂用量少等诸多优点[4]。作者通过对蛋白全抗原的有效固定，并采用内标-标准曲线法进行测定，该方法简单、快速、高效，灵敏度高且廉价，适合莱克多巴胺的大规模检测。

1 实验部分

1.1 实验装置

微珠芯片在线检测系统如图1所示，本系统包括蠕动泵，微珠芯片，六通阀，以及相关管路，其中中间的六通阀为枢纽控制整个免疫检测过程，图1中2种状态分别显示洗涤，进样图1（a）和循环反应图1（b）。

图1 实验装置示意图Fig.1 Schematic of setup

1.2 试剂和仪器

Tweem 20；1，4-丁二醇二缩水甘油醚,美国Sigma公司；小牛血清白蛋白，美国Sigma公司；莱克多巴胺标准品，二氧化硅微珠，氨基显色剂TNBS，莱克多巴胺单克隆抗体，美国Biodesign公司；Cy5/Cy3标记羊抗鼠IgG，美国Rockland公司；3-氨丙基三甲氧基硅烷APTMS，美国Sigma公司；pH试纸，考马斯亮蓝250。

Milli-Q型超纯水系统，美国Millipore公司；真空干燥箱，上海一恒科技有限公司；管式流动芯片分析仪；Centrifnge 5415R型冷冻离心机，德国Eppe ndorf公司；台式恒温振荡器，上海精宏仪器设备有限公司；G-560E型漩涡混匀仪，美国Scientific indu stries公司；电热恒温培养箱，上海精宏仪器设备有限公司，Genepix扫描仪，基因公司。

1.3 检测原理

本实验是基于竞争免疫反应的原理实现的，在免疫反应中，抗体可以和对应抗原特异性结合，而抗抗体（二抗）又可以抗体结合，本实验将所测物质作为抗原固定在玻璃微珠载体上，然后将待检物和对应抗体混合液同微珠上固定的抗原探针反应，这时，溶液中抗原（待检物）和微珠表面上抗原就会竞争结合溶液中的相应抗体，洗涤后，加入荧光标记二抗会同已在微珠表面共价结合的抗体结合，而通过扫描就可以捕捉到已结合的荧光信号，就可以表征一抗和微珠上抗原探针的结合程度，用抗原标准品和探针竞争的方式可以得到此免疫竞争的标准曲线，就可以对照得到同样条件竞争反应的实际样本浓度。

1.4 微珠表面修饰策略

1.4.1 微珠表面的化学修饰

（1）二氧化硅微珠的羟基化修饰

用1.5 mL离心管称量100 mg二氧化硅裸珠，用去离子水洗净，加入1 mL6 mol/LHCl，37℃振荡反应过夜，然后用去离子水洗涤至中型，110℃真空干燥过夜。

（2）二氧化硅微珠的硅烷化修饰

氨基硅烷化，具体操作是：羟基化珠干燥完成后，加入含2%的2，3-氨丙基三甲氧基硅烷甲苯溶液，反应5 h,然后110℃真空干燥2 h，用TNBS显色剂检验其反应效果，保存待用，此珠称为氨基珠。

（3）二氧化硅微珠的功能化修饰

通过系列实验发现，在氨基硅烷化基础上进行环氧化，可以有效固定小分子的牛血清蛋白全抗原环氧化,在500 μL 1，4-丁二醇二缩水甘油醚（butane-1，4-diol diglyciydyl ether）的 PBS（pH 7.4）缓冲液中加入10 mg氨基珠，37℃反应16 h，用PBS（pH 7.4）缓冲液洗涤3遍，无水乙醇洗涤1遍，常温真空干燥。

1.4.2 间接荧光免疫实验法过程

（1）固定探针

将功能化修饰微珠与莱克多巴胺的蛋白BSA的偶联物混合在37℃反应过夜，之后用PBST，PBS各洗涤2遍。

（2）抗体抗原反应

将微珠在蠕动泵的作用下，泵入毛细管，然后用1 mL PBST和1 mL PBS导入管中进行洗涤，洗涤完成后，导入适量浓度的一抗和标准品（或样品）混合溶液50 μL，此时恰好将整个管路充满，然后将橡胶管两头连接，使之在加热板的恒温环境下循环流动反应，20 min后，再用1 mL PBST和1 mL PBS导入管中进行洗涤。

（3）抗体二抗反应

洗涤完成后，导入50 μL标记荧光的二抗，同一抗反应过程步骤，进行恒温封闭循环反应，20 min后，再用1 mLPBST和1 mLPBS导入管中进行洗涤。

（4）信号获取及数据处理

洗涤完后使用Genepix扫描仪进行扫描，并分析图形及进行数据处理。

1.4.3 标准曲线的建立

采用间接竞争法绘制小分子竞争浓度标准曲线。采用6条携带6组固定好该探针微珠的毛细管的橡胶管路，分别导入15 μL稀释度为1︰100的单克隆抗体（1 mg/mL）和15 μL浓度（μg/L）分别为0，0.01，0.1，1，10，100标准品的混合样。然后按

1.4.2方法进行分析,最后得到经过6点梯度浓度的标准曲线，通过不断优化改变单抗浓度，以期得到竞争性强的标准曲线。优化完成后，确定最低检测限，各取检测区间内两点做加标回收率测定。

1.4.4 实际样本检测

实际样本检测：对于每一种实际样本用固定有莱克多巴胺抗原的微珠进行检视，反应流程与上述检测方法相同，同时做标准曲线，实际样本得到的信号与标准曲线进行比较，反应完成后，可即时得到样本里各种残留的含量。

2 结果与讨论

2.1 微珠表面修饰策略

2.2 一抗、羊抗鼠IgG二抗反应时间优化

评价检测方法的重要方面是检测时间，所以有必要对2次免疫反应进行一系列的优化，首先就是对反应时间的优化，一抗反应时间和二抗反应时间的优化，设置了一组时间梯度5，10，15，20，30 min来进行一抗反应时间优化，图2信号图是反应结果。

从图2可以看出，一抗反应在15 min，二抗反应在10 min时反应信号分别进入平台期，所以可确定优化结果一抗反应15 min，二抗反应10 min，反应中洗涤，加样等时间需要20 min，所以本系统-微珠芯片多元检测总体需要45 min时间。图中对全抗原的浓度进行梯度稀释，发现RAC-BSA为7.06 mg/mL时，为其2倍稀释下限，为有明显信号的最低浓度，为节约原则，选取这一浓度点为实验浓度。

图2 免疫反应时间优化结果Fig.2 Optimizationresults of Immune reactiontime

2.3 标准曲线的绘制和回收率测定

2.3.1 一抗浓度优化

在标准曲线的优化过程中，一抗浓度是一个关键指标，因为它决定免疫竞争反应的竞争性，一抗浓度浓度如果太低，探针结合量小，则普遍信号就比较微弱，一抗浓度如果太高，所有探针都被饱和结合，普遍信号就比较强，也没有强烈的竞争反应趋势，所以合适的一抗浓度应该是让探针与标准品有一个充分竞争反应效果，表现是在标准曲线上有一个明显的竞争下降趋势。以莱克多巴胺为例，讲述其优化过程：

标准曲线条件的优化主要是其一抗浓度的优化，其浓度高时，结合位点被饱和，信号普遍较高，竞争性较弱，随着一抗浓度下降，信号降低的同时，竞争性也在加强，当Rac一抗浓度为4.75 μg/mL时，竞争性最好，在0.01～1.00 μg/L上有明显的下降趋势，但一抗进一步稀释时，信号普遍明显降低，竞争性有趋缓，根据实验要求，需要较强的竞争性，所以选9.5 μg/mL为最佳一抗反应浓度，在此条件下得到的标准曲线如图3。

图3 莱克多巴胺标准曲线Fig.3 Calibrationcurve of clenbuterol

完成优化之后，就可以按照确定的优化结果进行微珠芯片实时检测的实验，制作标准曲线，同时检测实际样本，实现高效检测。

2.3.2 回收率测定

测定加标回收率是评价任何一种检测方法的必要程序，根据莱克多巴胺的检测区间取2个浓度点进行加标回收的测定，各平行测定5个样，并测定其平均回收率和测定数据的离散程度CV，见表1。并利用3倍标准偏差的计算方法确定最低检测限，为0.03 μg/L，检测范围为0.04～1.00 μg/L，IC50为0.76 μg/L。

表1 莱克多巴胺加标回收测定Table 1 Determinationof standardadditionrecovery of ractopamine

2.3.3 实际样品检测

用微珠芯片分析平台对来自猪肉和猪肝的100个样品做了莱克多巴胺的残留检测，结果阳性符合率为100%，阴性符合率为98.4%。

3 结论

在环氧化微珠表面固定了小分子莱克多巴胺的蛋白全抗原，并采用基于此的微珠芯片实时检测平台，实现了对莱克多巴胺的在线检测，最低检测限达到0.04 μg/L，检测范围为0.04～1.00 μg/L，并且1次检测时间不超过45 min。该系统灵敏、准确、廉价，所以适宜大规模检测的初筛实验，并能在食品检测中发挥作用。

[1]Prest，J.E.Determination of metal cations on miniaturised planar polymeric separationdevices using isotachophoresis withintegrated conductivity detection[J].Analyst，2001,126（4）：433-437.

[2]Ito，T，Audi，A.A，Dible，G.P.Electrochemical characterization of recessed nanodisk-array electrodes prepared from track-etched membranes[J].Anal Chem，2006，78（19）：7048-7053.

[3]Kurita，R.On-chip enzyme immunoassay of a cardiac markerusing a microfluidic device combined with a portable surface plasmon resonance system[J].Anal Chem，2006，78（15）：5525-5531.

[4]Moran-Mirabal，J.M.Micrometer-sized supported lipid bilayer arrays for bacterial toxin binding studies through total internal reflection fluorescence microscopy[J].Biophys J，2005，89（1）：296-305.

Detection of Ractopamine Residue in Meat Product by Microbead Biochip Based on Immunization

HU Lei，ZUOPeng，YEBang-ce
（School of Biotechnology，EastChinaUniversity of Science andTechnology，Shanghai 200237，China）

A kind of fluidic biochip based on competitive immunoreaction occurred on the funcational bead was constructed，the holoantigenof small molecularractopamine was immobilized on the epoxy-modified beads，then it reacted with the primary antibody and secondary antibody in turn.At last，signal was outputted.The internal standard-calibration curve method was used in detection，a calibration curve of competitive immunoreaction was made by using the standard sample before detecting actual samples，then detection of actual samples was carried out.The LOD（limit of detection）reached0.03 μg/L，detectiontime was less than45 min.

Microbeadbiochip；Epoxidation；Ractopamine；Drug residue；Limitof detection

O658

A

1671-0460（2010）04-0481-04

2010-06-28

胡 磊（1987-），男，湖北荆州人，硕士研究生，主要从事生物芯片研究。E-mail：hl3632086@163.com。