6周无负重游泳运动降低SHR大鼠血压的血浆蛋白质组学研究

冯 红，武晶琼，周春明，何庆华，温 利

6周无负重游泳运动降低SHR大鼠血压的血浆蛋白质组学研究

冯 红1，武晶琼2，周春明2，何庆华2，温 利3

目的：运用比较蛋白质组学技术，探讨6周无负重游泳运动降低SHR大鼠血压血浆蛋白质表达的变化，以期进一步阐述运动治疗高血压病的机制。方法：以雄性4周龄SHR大鼠16只及WKY大鼠16只为研究对象，将其随机分为SHR运动组、SHR安静组、WKY安静组、WKY运动组。SHR运动组及WKY运动组进行1 h/天，5天/周，共6周的无负重游泳运动。使用CODATM2单通道无创血压测量仪检测老鼠血压，对处理好的血浆样品进行二维凝胶电泳和质谱分析。结果：（1）6周无负重游泳运动可以有效降低SHR大鼠的血压。（2）通过质谱分析和数据库检索，成功鉴定了6个差异蛋白：rCG45257、锚定蛋白重复域13家族成员D、甲状腺素转运蛋白A链、Ras相关域1家族同型A、胎球蛋白B前体和γ-肌动蛋白。

6周无负重游泳运动；高血压；血浆蛋白质组学；SHR

高血压严重危害人类的生命健康。目前关于高血压，特别是原发性高血压的发病机制尚不十分了解，体力活动是其中一个重要的环境因素。最近的研究发现，体力活动水平和血压呈负相关。除此之外，研究还发现体力活动具有降压的作用。长期从事体力活动具有明显和稳定的降压作用，而且可以减少降压药物的剂量[1]。目前对高血压运动干预的分子生物学研究已取得了一些进展。研究发现，运动可以引起与血压有关的多个关键蛋白质表达的改变，但以往关于高血压运动干预的研究技术，受限于多种蛋白质的分析效率和鉴定靶蛋白的特异抗体的有效性，不能全面分析高血压运动干预时机体的变化。本研究拟采用比较蛋白质组学分析法，系统地进行运动改善高血压血浆相关蛋白质的蛋白质组研究，通过对运动改善高血压大鼠模型的建立、大鼠血浆蛋白质双向电泳图谱的制备、分析与鉴定，寻找差异表达蛋白并探讨其功能，从蛋白质组学的角度探索运动治疗高血压的分子机制。

1 实验材料

1.1 动 物

以4周龄，雄性，SHR大鼠（16只）及WKY大鼠（16只）为研究对象，SHR大鼠随机分为SHR安静组（n=8），SHR运动组（n=8），WKY大鼠随机分为WKY安静组（n=8），WKY运动组（n=8），4组均在通风、恒温（24±1）℃、湿度适宜、自然采光的动物室内饲养。

1.2 试 剂

双向电泳试剂及蛋白定量试剂盒均购自Amersham Pharmacia公司，乙腈、水及甲酸购于Merck公司。TPCK修饰的测序级胰蛋白酶购于Promega公司。蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF）及高丰度蛋白去除试剂盒购自Merck公司，蛋白银染试剂盒及DNA酶购自GE Amersham Biosciences公司。

作者单位：1.天津体育学院健康与运动科学系，天津300381；2.天津体育学院研究生部，天津300381；3.山西省吕梁市人民医院体检中心，山西吕梁3000031。

1.3 设 备

GE Amersham Biosciences公司蛋白质学研究配套仪器：IPGphor等电聚焦仪，Ettan DALTⅡ双向垂直电泳仪，ImageMaster 2D Platinum 6．0凝胶图像分析软件，Labscan扫描控制和分析前处理软件，Imagescanner扫描仪。DU800型可见-紫外分光光度计来自Beckman公司，液质联用质谱仪LCQ Deca XP来自Thermo Electron公司。

2 实验方法

2.1 建立运动改善自发性高血压大鼠血压的模型

2.1.1 运动方案 大鼠适应饲养环境一周后，进行一周适应运动，水温36℃，水深50 cm，从15 min开始递增，第7天时可以游1 h。以后在水温36℃，水深50 cm条件下进行无负重游泳运动，1 h/天，5 天/周，共运动 6 周。

2.1.2 血压的测定 使用CODATM2单通道无创血压测量仪，每周检测大鼠血压一次，每只大鼠的测量时间尽量固定在同一时间。

2.1.3 取 材 用10%的水合氯醛麻醉大鼠，麻醉满意暴露大鼠腹主动脉，以5 mL一次性注射器，针尖斜面向上刺入腹主动脉，缓慢抽血，约5 mL。拔去针头，轻轻推入5 mL抗凝管中，室温下，3 000 r/min，离心15 min，吸取上层血浆，并分装于200 μL离心管，-80℃冰箱保存备用，避免反复冻融。

2.1.4 去除高丰度蛋白 使用德国Merck去除高丰度蛋白试剂盒，快速、高度特异性地除去血浆中的白蛋白免疫球蛋白IgG，以利于低丰度蛋白的检测，并对处理后的样品以考马斯亮蓝法进行蛋白定量。

2.2 制备血浆二维凝胶电泳图谱

2.2.1 第一向等电聚焦 用样品溶解缓冲液（9 M尿素，4%CHAPS，2%IPG 缓冲液，40 mM DTT，40 mM Tris-base） 溶解样品。处理好的样品250 μg，加入水化液，使样品和水化液的总体积等于 450 μl。等电聚焦参数：30 V，12 h；200 V，1 h；500 V，1 h；1000 V，1 h；8 000 V，9 h。

2.2.2 第二向SDS电泳 IPG胶条平衡2次，每次10 min，平衡缓冲液包括6 M尿素和30%甘油。将平衡好的IPG胶条小心放置于制好的SDS胶面上，使IPG胶条与SDS胶面充分结合，0．5%的琼脂糖溶液封顶。二向电泳参数为：1 W/胶条 1 h；10 W/胶条5 h。当溴酚蓝染料迁移到胶的底部边缘即可结束电泳。考马斯亮蓝染色6 h，脱色12 h。染色凝胶用Imagescanner扫描仪进行扫描，ImageMaster 2D Platinum 6．0凝胶图像分析软件分析电泳结果。图像分析时将SHR运动组的凝胶选做参考胶，其他组胶与参考胶进行匹配。蛋白质点归一化定量后输出数据到Microsfot Excel 2000中进行统计分析，差异显著性分析采用 Student's T-Test。

2.3 差异候选蛋白的质谱分析

2.3.1 蛋白斑点的脱色和胶上原位酶切 选取二维电泳凝胶上的候选蛋白斑点，并切成1 mm2大小的胶片，另切一块无蛋白的2-DE凝胶作为空白对照，置于EP管中，-20℃冻存。将切下的胶片用去离子水冲洗3次，用50%丙烯腈/25 mmol/L碳酸氢铵水溶液（400 μL，pH8．0）振荡脱色，胶块真空离心干燥。加入10～15 μL胰蛋白酶液，覆盖胶块，4℃放置30 min，吸胀后，吸出多余酶液，37℃空气浴16～20 h。

2.3.2 肽混合物的提取 吸出反应液，置E P管中，加入50%AC/5%TEA水溶液溶解，轻微振荡萃取60分，离心吸上清，置前一EP管中，再萃取一次。合并萃取液（反应液和两次萃取液）冷冻真空抽干约l h，4℃冰箱保存。

2.3.3 质谱分析 浓缩后的肽段抽提液通过C18-高压液相色谱仪偶联的装有自动进样器、微量电喷雾离子化源及离子阱质量分析器的液质联用质谱仪LCQ Deca XP进行分析。

2.4 数据库检索初步鉴定蛋白质

数据库检索程序根据输入的蛋白质等电点、分子量范围及肽质量指纹谱数据和其他一些参数在数据库中寻找与这些参数相匹配的蛋白质。检索数据库为：htto：／／www．matrixscience．com。

2.5 统计学处理

所有实验数据由SPSS统计软件（SPSS13．0 for Windows）处理，计算均值和标准差（±S），组间比较采用双因素方差分析，组内比较采用配对T检验，显著性标准为：P＜0．05。

3 实验结果

3.1 6周无负重游泳运动对SHR大鼠和WKY大鼠血压的影响

4组大鼠6周游泳训练前，收缩压、舒张压、平均动脉压的情况见表1。运动前，SHR大鼠收缩压、舒张压、平均动脉压明显高于WKY大鼠；SHR大鼠随周龄增长，收缩压、舒张压、平均动脉压呈持续上升趋势。运动后，SHR大鼠收缩压、舒张压、平均动脉压仍然高于WKY大鼠，且SHR安静组的增高幅度显著高于SHR运动组，P＜0．01。游泳运动训练后的SHR运动组大鼠收缩压、舒张压、平均动脉压与SHR安静组大鼠相比第4周即开始下降，运动6周后降低具有显著性P＜0．01；6周游泳训练后，SHR运动组收缩压、舒张压、平均动脉压较运动前没有显著性变化，但SHR安静组这3个指标比6周前显著升高，P＜0．05。WKY大鼠运动组和安静组在这6周内收缩压、舒张压、平均动脉压的变化均不具有显著性。

3.2 各组血清蛋白质2-DE图谱的制备和比较

3.2.1 各组血浆蛋白质2-DE谱图的制备 将去除高丰度蛋白后的SHR运动组，SHR安静组，WKY安静组，WKY运动组血浆进行二维凝胶电泳。图象经ImageMaster 2D Platinum 6．0凝胶图像分析软件分析发现，在SHR安静组蛋白质质谱图中发现674个蛋白点，在SHR运动组蛋白质质谱图中发现644个蛋白点，在WKY安静组蛋白质质谱图中发现695个蛋白点，在WKY运动组蛋白质质谱图中发现627个蛋白点。以SHR运动组血浆蛋白质2-DE谱图中作为参考胶，其他谱图与之匹配，WKY安静组血浆蛋白质质谱图的平均匹配率为 73．0396%，WKY运动组血浆蛋白质质谱图的平均匹配率为74．1149%，SHR安静组血浆蛋白质质谱图的平均匹配率为77．3900%。

表1 6周无负重游泳运动对SHR大鼠和WKY大鼠血压的影响（mmg）Table 1 Effects of six-week load-free swimming on the blood pressure in SHR and WKY rats（mmg）n=8

3.2.2 运动改善高血压血浆蛋白质的表达变化 经过对数据的统计分析，SHR运动组与SHR安静组相比较，共发现13个蛋白点的含量发生了明显改变，其中在SHR运动组血浆中有6个蛋白点升高，7个蛋白点降低；SHR运动组与WKY运动组相比较，有33个蛋白点的含量发生了明显改变，其中在SHR运动组血浆中有8个蛋白点升高，25个蛋白点降低；SHR运动组与WKY安静组相比，27个蛋白点的含量发生了明显改变，其中在SHR运动组血浆中有20个蛋白点升高，7个蛋白点降低；SHR安静组与WKY安静组相比较，发现33个蛋白点发生了明显改变，其中在SHR安静组血浆中8个蛋白点升高，25个蛋白点降低。它们在凝胶中的位置见图1所示。统计分析显示这些差异蛋白点的相对含量均具有显著性差异。

图1 运动改善高血压血浆中表达差异的蛋白点分析Fig.1 Analysis of proteins for different expression in plasma under the condition of high blood pressure after exercise

3.3 差异蛋白质的鉴定

选取有显著改变的6个差异蛋白点，经过胶内酶切和MALDI-TOF-MS质谱分析后，得到了各个蛋白点的肽质量指纹谱图，鉴定出了6个差异表达的蛋白质（见表2）。与SHR安静组相比，3个蛋白质在SHR运动组血浆中含量升高，这些蛋白包括：锚定蛋白重复域13家族成员D、胎球蛋白B前体和γ-肌动蛋白。3个蛋白质在SHR运动组血浆中含量降低包括：甲状腺素转运蛋白A链、Ras相关域1家族同型A和rCG45257。

4 讨 论

4.1 6周无负重游泳运动对SHR大鼠和WKY大鼠血压的影响

Song等人的研究指出，4周游泳训练可以使SHR大鼠收缩压由 （208．4±6．8）mmHg 显著下降到 （187．2±4．1）mmHg[2]。Bobillier等人发现3周龄雄性SHR大鼠经过8周游泳训练后收缩压下降了24 mmHg[3]。Vogt亦认为游泳运动可以使SHR大鼠运动组比安静组收缩压和舒张压显著下降[4]。本实验结果显示，与SHR安静组相比，SHR运动组血压4周开始下降，至6周末非常显著性下降（P＜0．01），说明6周无负重游泳运动能有效降低SHR大鼠的血压。

表2 鉴定出的蛋白质的名称Table 2 ldentified proteins

4.2 运动改善SHR大鼠血压的血浆蛋白质组学分析

应用双向凝胶电泳技术对去除白蛋白后的大鼠血浆进行分析，选取6个浓度上变化比较大的蛋白点进行质谱鉴定。其中有4个蛋白既在运动改善SHR血压过程中有变化，又在SHR发病过程中有变化即：rCG45257、锚定蛋白重复域13家族成员D、甲状腺素转运蛋白A链、Ras相关域1家族同型A；有2个蛋白只在运动改善SHR血压过程中发生变化，它们分别是胎球蛋白B前体和γ-肌动蛋白。由于rCG45257是尚未被命名的蛋白产物，现将主要蛋白的功能总结如下。

4.2.1 甲状腺素转运蛋白A链 甲状腺素运载蛋白在体内大多数为同源四聚体，少数以单体形式存在[5]。其每个亚单位含有125～136个氨基酸序列，这些氨基酸序列形成β折叠结构，以利于维持分子结构的稳定性[6]。临床和基础研究均发现，甲状腺素运载蛋白与老年全身性淀粉样变性、家族性淀粉样多神经病、家族性淀粉样心肌病有一定的相关性。但至今尚无甲状腺素运载蛋白A链的相关报道。

4.2.2 Ras相关域家族1同型A Rass相关域家族1（Rassf1）蛋白是肿瘤抑制基因的产物，得到了大家广泛的关注[7-9]。Rassf1的编码基因位于染色体3p21．3上，大约 11 000 bp，它包括8个外显子和2个不同的启动子，进行选择性剪接后可以形成8个不同的转录物，即Rassf1A-Rassf1H。目前只有Rassf1A和Rassf1C的生物学意义被广泛研究[10]。Rassf1A分子量为39 kDa，包含340个残基。Rassf1A和Rassf1C在C-氨基端有4个相同的外显子，Rassf1A的N-氨基端有一个锌指结构，与蛋白激酶C保守区域C1具有很高的同源性[11]。

Rassf1A已经被公认为在各种肿瘤中的肿瘤抑制因子[12-13]。研究发现，Rassf1 A经常在许多癌症细胞链和新生组织中缺失[11，14-15]。Rassf1A具有传递抑制生长的信号的功能，在肿瘤形成过程中这些起抑制作用的信号通路可能会被灭活Rassf1A在C-氨基端Salvador Rassf Hippo（SARAH）区后的，与蛋白相互作用有关的Ras相关区域（RA区）发挥这些生物学作用[16]。Rassf1A已经被证明可以和有活性的Ras即Ras．GTP相结合提示它可能是Ras的一种效应器。Rassf1A已经被证明存在于心肌细胞中，并且与钙离子泵在肌浆中有相同的定位点[17]。持续的机械压力存在时，Rassf1A缺乏会通过增加ERK1/2信号通路的活性，引起心肌肥大和心室结构改变。

4.2.3 γ-肌动蛋白 γ-肌动蛋白的分子量为43 KD，根据氨基酸和cDNA序列可将γ-肌动蛋白分为平滑肌γ-肌动蛋白和胞浆γ-肌动蛋白。哺乳动物中通常γ-肌动蛋白分布在内脏器官平滑肌，而血管平滑肌主要分布为α-肌动蛋白。肌动蛋白亚型表达与平滑肌分化状态之间的有一定的联系，平滑肌细胞处于分化状态时γ-肌动蛋白表达增加和α-肌动蛋白表达降低，去分化状态时肌动蛋白亚型的表达正好相反[18]。有学者推测，γ-肌动蛋白表达增加及其转运到细胞膜可能通过以下机制促进平滑肌收缩：增加组织中收缩蛋白含量和支持肌细胞与周围胶原蛋白基质的相互作用[19]。平滑肌细胞是血管中最主要的细胞，其主要功能在于维持血管结构与血压的调控。当血管处于病变情况下，平滑肌细胞表型的改变是一个主要的特征。很多学者对管壁压力对容量血管的影响进行了大量研究，并一致认为：管壁压力可以通过扩张血管容量，重塑管腔结构来维持组织的物理应力处于相对正常水平。在此过程中，血管平滑肌细胞收缩以弥补血管损伤部位的再生障碍，其发生机制类似于血管成形术后的动脉粥样硬化和再狭窄[20]。此外，有文献报道，当心脏扩大和肥厚的小鼠特异性心脏α-肌动蛋白缺陷时内脏平滑肌γ-肌动蛋白的异位表达来弥补[21]。而且细胞质中多余的的γ-肌动蛋白是肌营养不良蛋白的缺失时会导致细胞信号传导或基因表达异常的原因[22]。

5 结 论

（1）6周无负重游泳运动可以有效降低SHR大鼠的血压。（2）通过质谱分析和数据库检索，成功鉴定了6个差异蛋白，分别为：既在运动改善SHR血压过程中有变化，又在SHR发病过程中有变化的蛋白质：rCG45257、锚定蛋白重复域13家族成员D、甲状腺素转运蛋白A链、Ras相关域1家族同型A；只在运动改善SHR血压过程中发生变化的蛋白质：胎球蛋白B前体和γ-肌动蛋白。

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Plasma Proteomics of Six-Week Load-Free Swimming Training Decreasing Blood Pressure in SHR

FENG Hong1，WU Jingqiong2，ZHOU Chunming2，HE Qinghua2，WEN Li3
（1.Dept.of Health&Exercise Science，Tianjin University of Sport，Tianjin 300381，China；2.Dept.of Postgraduate，Tianjin University of Sport，Tianjin 300381，China；3.Medical Center of Luliang People's Hospital，Luliang 3000031，China）

Objective：Using the comparative proteomics method，the plasma protein expression was examined under the situation of blood pressure decreased by six-week load-free swimming training in spontaneously hypertensive rats（SHR）to further demonstrate the mechanism of hypertension improved by exercise.Methods：Sixteen male four-week old SHR and sixteen Wistar-Kyoto （WKY）rats were randomly divided into SHR exercise group，SHR rest group，WKY exercise group and WKY rest group.Rats in SHR exercise group and WKY exercise group exercised with a six-week load-free swimming protocol（1 hour per day，5 days per week）.The blood pressure of rat was tested by CODATM2 single non-invasive blood pressure measurement appliance.The samples were used to do the two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry.Results：The blood pressure was decreased significantly after six-week load-free swimming.The six proteins were identified by mass spectrometry and data base retrieval.They are rCG45257，similar to ankyrin repeat domain 13 family，member D，chain A，rat Transthyretin，Ras association domain family 1 isoform A，fetuin B precursor and γ-actin.

six-week load-free swimming；hypertension；plasma proteomics；SHR

G 804.7

A

1005-0000（2010）05-0400-04

2010-06-07；

2010-09-06；录用日期：2010-09-10

天津市高等学校科技发展基金项目（项目编号：20060201）

冯 红（1971-），女，天津市人，副教授，博士，研究方向为运动生理学、细胞与分子生物学。