叶秀波 ,岑帼英 ,李瑞明
(1.广州市海珠区中医院,广东广州 510220;2.中山大学附属第一医院药学部,广东广州 510080)
银杏叶软胶囊是由银杏提取物与适量的基质制成的软胶囊,银杏提取物中含有黄酮类化合物和银杏总内酯两类生物活性物。其中,总黄酮类包括槲皮素、山奈素、异鼠李素等,共同作用于心脑和外周末梢血管系统,促进血液循环和改善末梢血液的运行,从而预防血管系统循环障碍所引起的各种症状。另外,黄酮类化合物有清除游离氧的抗氧化等药理作用[1]。本文用HPLC法测定总黄酮的含量,为建立银杏叶软胶囊质量控制方法提供依据。
LC-2010高效液相色谱仪 (日本岛津公司);KQ-300超声清洗仪 (昆山市超声仪器有限公司);色谱柱Agilent C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)。
槲皮素对照品(供含量测定用,批号:10081-200406,中国药品生物制品检验所);山奈素对照品(供含量测定用,批号:110861-200303,中国药品生物制品检验所);异鼠李素对照品(供含量测定用,批号:110860-200205,中国药品生物制品检验所);甲醇为色谱纯,水为重蒸馏水,其他试剂均为分析纯,银杏叶软胶囊(批号:080510、080920、091026,广州美丽康有限公司)。
采用 Agilent C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱,流动相为甲醇-水(50∶50)(用磷酸调 pH 为 2.5),流速为 1.0 ml/min,检测波长为360 nm[2],柱温为30℃。在本条件下,槲皮素、山奈素、异鼠李素能达到较好分离,其他成分对测定无干扰,结果见图1。
2.2.1 混合对照品溶液的制备 精密称取槲皮素、山奈素、异鼠李素对照品适量加甲醇制成槲皮素浓度为 1.0 mg/ml、山奈素浓度为0.1 mg/ml、异鼠李素浓度为0.1 mg/ml的单一成分对照品贮备液。分别精密量取上述槲皮素对照品贮备液4 ml、山奈素对照品贮备液4 ml、异鼠李素贮备液1 ml,置10 ml量瓶中用甲醇定容至刻度,摇匀,即得槲皮素浓度为0.4384mg/ml、山奈素浓度为0.042 2 mg/ml、异鼠李素浓度为0.010 0 mg/ml的混合对照品溶液[3-6]。
2.2.2 供试品溶液的制备 取本品装量差异下的内容物2 g,精密称定,加20 ml甲醇超声提取30 min,滤过,滤液加入1.5 mol/L盐酸溶液20 ml,水浴回流3 h,冷却后用甲醇定容至50 ml量瓶,摇匀,过0.45 μm微孔滤膜滤过,即得[3]。
精密吸取“2.2.1”项下槲皮素、山奈素、异鼠李素备用对照品溶液加甲醇配制成含一系列浓度的混合溶液:对照品溶液1(含槲皮素 0.050 mg/ml、山奈素 0.005 mg/ml、异鼠李素0.005 mg/ml),对照品溶液 2(含槲皮素 0.100 mg/ml、山奈素0.010 mg/ml、异鼠李素 0.010 mg/ml),对照品溶液 3(含槲皮素 0.150 mg/ml、山奈素 0.015 mg/ml、异鼠李素 0.015 mg/ml),对照品溶液4(含槲皮素0.300 mg/ml、山奈素0.030 mg/ml、异鼠李素0.030 mg/ml),对照品溶液 5(含槲皮素 0.400 mg/ml、山奈素0.040 mg/ml、异鼠李素0.040 mg/ml)。精密吸取上述对照品溶液各进10 μl记录峰面积,以峰面积Y为纵坐标,进样量X(mg/g)为横坐标进行线性回归,得槲皮素、山奈素、异鼠李素的回归方程分别为:槲皮素Y=31 248 671X-15 558(r=0.999 5);山奈素 Y=30 421 567X+614 692(r=0.999 9);异鼠李素Y=24 180 214X-225 760(r=0.999 7)。结果表明槲皮素、山奈素、异鼠李素进样量分别在0.050~0.400、0.005~0.040、0.005~0.040 μg范围内与峰面积呈良好线性关系。
精密吸取混合对照品溶液10 μl,重复进样5次,记录峰面积。结果槲皮素、山奈素、异鼠李素的峰面积的RSD分别为1.8%、1.7%、1.6%。结果表明本法精密度良好。
取银杏叶软胶囊(批号:080510)的供试品溶液,分别于(0、1、2、4、8、12、24 h)进样 20 μl记录峰面积,结果槲皮素、山奈素、异鼠李素的峰面积的RSD分别为2.8%、2.5%、2.8%。结果表明供试品溶液在24 h内基本稳定。
取同一批号银杏叶软胶囊 (批号:080510)各6份,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,分别进样20 μl,记录峰面积,计算含量,再按总黄酮醇苷含量=(槲皮素含量+山柰素含量+异鼠李素含量)×2.51[2]计算,样品中槲皮素、山奈素、异鼠李素的含量分别为2.33、0.19、0.06 mg/粒,总黄酮醇苷平均含量为6.46 mg/粒(RSD=1.5%)。结果表明本法重复性良好。
精密称取已知含量的同一批号银杏叶软胶囊 (批号:080510)适量,按表1精密加入对照品,按供试品溶液制备项下操作测定,结果见表1。
表1 回收率试验结果(n=9)Tab.1 Results of recovery test(n=9)
分别取3批银杏叶软胶囊样品,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液。分别精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液10 μl及供试品溶液20 μl,注入色谱仪,记录峰面积。按外标法计算样品中槲皮素、山奈素、异鼠李素的含量,并换算成总黄酮醇苷的含量,结果见表2。
表2 样品含量测定结果(%,n=3)Tab.2 Content determination results of samples(%,n=3)
在提取过程中,比较采用甲醇-25%盐酸溶液(4∶1)的混合溶液水浴加热回流法、甲醇超声提取、盐酸加热水解法三种不同的提取方法,结果表明盐酸水解法效果较好,能将黄酮醇苷类成分水解完全。
为了使所检测的色谱峰分离度好,出峰时间合理,试用甲醇-0.4%磷酸溶液(50∶50)及甲醇-水(50∶50)(用磷酸调pH=2.5),结果选用甲醇-水(50∶50)(用磷酸调 pH=2.5)作为流动相时各个色谱峰的分离效果好。
[1]李冶,郑伟文.银杏叶提取物的药理研究与临床应用[J].现代食品与药品杂志,2007,2(31)∶1452-1454.
[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京∶化学工业出版社,2005∶153.
[3]卫生部.保健食品检验与评价技术规范手册[S].北京∶清华同方电子出版社,2003.
[4]马梅芳,吕文海.HPLC法同时测定南葶苈子饮片中槲皮素、山奈素及异鼠李素的含量[J].中国药事,2009,(1)∶65-67.
[5]杜瑞芳,王雨梅,刘卫东,等.高效液相色谱法同时测定沙枣中槲皮素和异鼠李素的含量[J].时珍国医国药,2008,4(19)∶831-832.
[6]丁立新,李春英,孙启芬.高效液相色谱法同时测定小叶金钱草中槲皮素和山奈素的含量[J].黑龙江医药科学,2009,32(5)∶458.