活血开窍法对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织兴奋性氨基酸的影响

张青萍,刘 泰,谭璐璐,梁丽英

脑缺血时缺血神经元大量释放兴奋性氨基酸(EAA)对神经元的损伤起着关键作用。适量的兴奋性氨基酸对于维持细胞的正常生理活动是必需的,但胞外兴奋性氨基酸浓度过高则会产生毒性,导致神经元损伤[1]。活血开窍法是治疗脑梗死的常用方法之一,以往实验研究表明,具有活血开窍作用的醒脑通脉胶囊(由田三七、胆南星、地龙、石菖蒲、冰片等组成)能提高血清超氧化物歧化酶(SOD)活力,清除机体自由基,减轻自由基对缺血脑组织的损伤;通过降低血栓素B2(TXB2)和增加前列环素(PGI2)的含量,使血管扩张,降低血小板聚集性,利于梗死灶的血液供应,对脑血栓形成疗效可靠[2]。

本实验采用改良线栓法[3]建立大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型,观察活血开窍法对脑损伤的保护作用及对脑组织谷氨酸(Glu)、天门冬氨酸(Asp)含量的影响,以期探讨其治疗缺血性脑血管病的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级Wistar雄性大鼠,体重 280 g～350 g,鼠龄4个月。由广西医科大学实验动物中心提供。实验动物生产许可证号:SCXK桂 2003-0003,使用许可证号:SYXK桂2003-0005。

1.2 主要试剂和药品 醒脑通脉胶囊由广西中医学院第一附属医院制剂室制备,按一定比例制成胶囊,每克含生药15 g;尼莫地平由山东新华制药股份有限公司提供(国药准字H10910080,产品批号0507132),每片20 mg;戊巴比妥钠:中国医药(集团)上海化学试剂公司,批号:F20020915,SCRC69020180。氨基酸标准品、其他试剂皆为国产分析纯试剂,由广西分析测试研究中心(中国实验室国家认可委员会认可实验室)有机化学分析室提供。

1.3 主要实验仪器 AR2140型电子分析天平,上海奥豪斯生产;5804R冷冻高速离心机,德国Centrifuge;L-8800全自动氨基酸分析仪,日本日立公司。手术器械:手术刀、手术剪、眼科剪、眼科镊、手术镊、止血钳、持针钳、动脉夹、三棱缝针、医用丝线(黑色 0号,上海浦东金环医疗用品有限公司,批号:12E081)、3-3.5号日本DUEL进口渔线。

1.4 方法

1.4.1 模型的制备及分组、给药 25只大鼠随机分为5组,每组5只,即正常组、脑缺血再灌注组、尼莫地平阳性对照组、醒脑通脉组(大小剂量共2组),其中除了正常组以外均制作成脑缺血2 h再灌注48 h的模型。采用线栓法制作大鼠大脑中动脉栓塞的局灶性脑缺血再灌注模型。正常组不造模;其余4组分别用2%戊巴比妥钠45 mg/kg腹腔注射麻醉,麻醉大鼠仰卧固定,颈部正中切口,钝性分离颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉,仔细分离避免损伤迷走神经,并结扎颈总动脉、颈外动脉。在颈总动脉分叉处剪一小口,以尼龙线从颈总动脉分叉处插入,进入颈内动脉,当线栓进入约1.8 cm,有阻力时表明线栓已达大脑中动脉起始端,并阻断大脑中动脉起始端及所有侧支血流循环,导致大脑中动脉局灶缺血,分别栓塞2 h后,轻轻回拉插线至颈总动脉切口处,制成再灌注模型,术后动物苏醒后即行神经功能缺失体征评分以评定模型成功与否。神经功能缺失体征评分:采用Longa等[4]的方法在术后进行5级制评分。评分标准:1级(0分)无神经缺损体征;2级(1分)不能充分屈曲对侧前爪;3级(2分)向麻痹侧转;4级(3分)向麻痹侧倾倒;5级(4分)不能自发行走,意识丧失。2级(1分)～4级(3分)为成功模型,计入实验动物数。醒脑通脉胶囊治疗组用蒸馏水把醒脑通脉胶囊备制成混悬液,按每次250 mg/kg(低剂量组),1 000 mg/kg(高剂量组)给药,分别在造模前给药2 d,每日 1次,在脑缺血2 h再灌注48 h后灌胃1次,脑缺血再灌注模型组给予生理盐水灌胃,阳性对照组给予尼莫地平灌胃,按每次2 mg/kg给药,给药时间同醒脑通脉胶囊治疗组。在脑缺血2 h再灌注48 h后灌胃1次后,约1 h处死大鼠,取脑检测。

1.4.2 检测方法 将大鼠断头取脑,去掉嗅球、小脑及低位脑干,快速取右侧大脑半球额顶叶皮层大脑组织约0.3 g,加200 μ L PBS在冰台上磨成匀浆,吸出匀浆液,在 18 000 r/min、4℃条件下离心20 min,取上清液加磺基水杨酸1:1沉淀,用孔径0.45 μ m 水系滤膜过滤,取25 μ L过滤后上清液直接上机检测氨基酸含量(高效液相色谱法)。

1.5 统计学处理 采用SPSS13.0版软件进行处理。计量资料以均数±标准差(±s)表示,各组间比较用one-way ANOVA 检验。

2 结 果

与正常组大鼠比较,模型组大鼠脑组织中Glu、Asp含量显著升高(P＜0.01);与模型组大鼠比较,醒脑通脉大、小剂量组脑组织中Glu、Asp含量显著降低;与尼莫地平组比较,醒脑通脉大剂量组脑组织中Glu、Asp含量显著降低(P＜0.05或 P＜0.01)。说明醒脑通脉大、小剂量组均可降低脑组织中 Glu、Asp的含量,且具有量效关系。详见表1。

表1 各组大鼠脑组织中Glu、A sp含量比较(±s)

表1 各组大鼠脑组织中Glu、A sp含量比较(±s)

组别 n Glu(μ g/mL) Asp(μ g/mL)正常组 5 39.00±10.391) 18.72±4.151)模型组 5 86.00±8.66 50.90±5.55尼莫地平组 5 68.72±8.901) 34.78±8.091)醒脑通脉大剂量组 5 54.94±2.051)2) 25.70±0.851)3)醒脑通脉小剂量组 5 74.42±9.331) 39.90±4.901)与模型组比较,1)P＜0.01;与尼莫地平组比较,2)P＜0.05,3)P＜0.01

3 讨 论

脑缺血损伤级联反应分为4个阶段,即兴奋性毒性、梗死灶周围去极化、炎症和细胞程序性死亡,在缺血后不同的时间分别出现,各阶段互有重叠并非孤立存在[5]。兴奋性毒性是指因兴奋性氨基酸受体激活引起的神经元细胞死亡[6]。级联反应都以兴奋性毒性开始,兴奋性毒性也可能是所有下游事件的触发者,可被看做是最重要的一个。由于其发生的时间极短(数分钟至数小时),治疗比较困难。脑缺血时,缺血神经元大量释放的EAA尤其是Glu对神经元的损伤起关键作用。由于EAA使神经元持续去极化,增加了神经元内Glu等的大量释放,又因脑缺血后三磷腺苷(ATP)降解,依赖能量而重吸收Glu的机制衰竭,影响Glu摄取功能,甚至出现Glu向细胞外液转移,如此恶性循环,突触间隙持续高浓度的Glu就引起兴奋性神经毒性[7]。故拮抗EAA兴奋性毒性,包括抑制其过度释放,促进其再摄取,以及抑制其受体活性,对脑缺血损伤具有防治作用。

有些活血开窍中药能影响级联反应中的某一阶段,同时还改善血液循环。马丽焱等[8]报告葛根总黄酮、三七总皂苷、氧化苦参碱、小檗碱可增加脑局部血流量。对培养的神经细胞,三七总皂苷能拮抗谷氨酸介导的兴奋性毒性。三七总皂甙直接保护脑细胞、改善组织血液循环是其作用的基础。醒脑通脉胶囊为活血开窍剂,功用活血化瘀祛痰,醒脑开窍通络。三七及其主要成分具有收缩血管,促进凝血作用;能抑制血小板聚集,降低血液黏度,具有活血作用;能减轻局部脑缺血后脑水肿,缩小梗死范围,因而具有抗脑缺血作用;现代药理研究表明石菖蒲可以有效抑制脑缺血再灌注后脑中Glu、Asp及γ一氨基丁酸(GABA)含量的异常升高,从而减轻上述物质在脑缺血-再灌注时对神经元的损害,进而起到脑保护的作用[9]。

本研究表明,缺血2 h再灌注48 h后,脑组织Glu和Asp含量明显增加,表明EAA的兴奋毒性参与了脑缺血后早期细胞损伤和迟发性神经损伤的发生过程。在本研究中,活血开窍法之醒脑通脉胶囊治疗组与缺血再灌注模型对照组比较,醒脑通脉胶囊能明显降低脑组织Glu和Asp含量,与缺血再灌注模型对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01),且具有量效关系。以上结果说明,活血开窍法可对抗缺血性脑损伤,防止再灌注时EAA的升高。提示活血开窍法抗缺血性脑损伤的作用机制可能与其对抗脑缺血再灌注后EAA的升高有关。

[1]赵刚,李树清.兴奋性氨基酸毒性与缺血性脑损伤[J].国外医学:脑血管疾病分册,2004,12(6):426.

[2]刘泰.自拟醒脑通脉胶囊治疗急性脑血栓的研究[J].临床荟萃,2000,15(19):867-868.

[3]罗勇,董为伟.Wistar大鼠插线法局灶性脑缺血/再灌注模型的实验研究[J].重庆医科大学学报,2002,27(1):124.

[4]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery:Occlusion without cranietomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[5]廖维靖,Frank W,Ulrich D.脑缺血损伤的病理生理机制-损伤级联反应[J].国外医学:脑血管疾病分册,1998,6(4):197-202.

[6]Beal MF.Mechanisms of excitotoxicity in neurologic diseases[J].FASEB J,1992,6(15):3338-3344.

[7]陈维洲,芮耀诚.脑血管疾病基础与临床研究[M].济南:山东科技出版社,1993:12-25.

[8]马丽焱,肖培根,郭宝林,等.几种中药成分对脑组织的保护作用[J].中国中药杂志,1999,24(4):238-239.

[9]柯雪红,方永奇.石菖蒲挥发油对脑缺血-再灌注脑中氨基酸的影响[J].中华老年学杂志,2003,23(5):302-303.