根癌农杆菌介导的西瓜遗传转化研究进展

李 娟 李万宁 唐 懿 李焕秀*

（1四川农业大学园艺学院，四川雅安 625014；2四川省双流县农村发展局，四川双流 610200）

根癌农杆菌介导的西瓜遗传转化研究进展

李 娟1李万宁2唐 懿1李焕秀1*

（1四川农业大学园艺学院，四川雅安 625014；2四川省双流县农村发展局，四川双流 610200）

介绍了根癌农杆菌介导的西瓜遗传转化的研究现状，综述了西瓜高效再生体系的建立和遗传转化过程中的主要影响因素，包括最佳外植体的选择、最适培养基的制备，以及抗生素、农杆菌菌株类型、菌液浓度、侵染时间、预培养时间、共培养时间和添加乙酰丁香酮等内容，讨论了西瓜遗传转化存在的问题，并对这一体系的发展进行了展望。

西瓜；遗传转化；根癌农杆菌；综述

近年来，人们已成功利用植物遗传转化的方法将多种目的基因导入植物，其中许多有价值的转基因植物已经或即将应用于生产。西瓜〔Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum. et Nakai〕是重要的经济作物，属葫芦科植物，其果实汁多味甜、营养丰富（张志忠 等，2005a），但遗传基础十分狭窄（许勇 等，1999），栽培种和野生种中抗病种质资源极为缺乏（林德佩，2003），通过常规育种方法选育抗病性稳定的品种较为困难。基因工程为培育出高产、优质、抗病虫、抗逆境的优良品种开辟了新途径，其中研究最清楚和应用最成功的是农杆菌介导的遗传转化，在已获得的近200种转基因植物中约80 %是由农杆菌介导完成的（王关林和方宏筠，1998a）。从已有的报道来看，该技术在西瓜上的应用有一定困难（Chen et al.，1998；任春梅和董延瑜，2000a；Ellul et al.，2003；Sang et al.，2005；），这可能与西瓜再生能力较弱、不易通过愈伤组织途径再生植株、遗传转化体系难以优化等有关。笔者对西瓜再生体系、转基因技术在西瓜育种上的应用进行了综述和展望。

到目前为止，已用于西瓜遗传转化的常用外源基因主要有以下三类：第一类是标记基因，如β-葡糖甘酸酶（GUS）基因、新霉素磷酸转移酶基因（NPTⅡ）；第二类是抗病基因，包括西瓜花叶病毒1号（WMV-1）、西瓜花叶病毒2号（WMV-2）、西葫芦黄化花叶病毒（ZYMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）；第三类是总dNA，包括抗枯萎病南瓜总dNA、抗枯萎病瓠瓜总dNA、银杏总DNA和pBll21dNA。这些基因在西瓜上的利用主要是为了建立有效的遗传转化体系。

1 西瓜高效再生体系的建立

1.1 最佳外植体的选择

从理论上讲，每一个植物细胞都有再生成完整植株的能力，即细胞全能性。但在实际应用中，西瓜组织的再生受植株基因型、种子贮藏年限、苗龄、外植体的大小和部位等多种因素的影响，其再生能力差别很大。很多研究证明西瓜的品种特性是影响转基因操作取得成功的关键，选择合适的转化受体很重要（Sparrow et al.，2004），西瓜子叶外植体具有高效的转化再生频率，被广泛用于转基因再生体系。

1.1.1 外植体基因型 适宜作为外源基因受体的植物细胞，应具备两个必需的条件：① 能够产生创伤信号分子，刺激农杆菌向植物细胞运动，并使农杆菌 vir基因活化和表达；② 具有脱分化和再分化能力，使转化细胞经离体培养能再生成完整植株。这两个特点都和植物的种属以至品种（基因型）有直接关系。

王果萍（2002）以西瓜自交系F-18、F-22、F-37为试验材料进行组织培养，结果品系间营养胚诱导的难易程度表现出明显的差异，F-18较其他品系容易诱导，诱导分化率达60.24 %，且易获得再生植株，能够满足基因转导的需要。张明方等（2006）采用浙蜜2号西瓜品种进行试验，结果表明西瓜子叶外植体在无Kan的MS培养基中再生率可达95 %。郝立新和王怀名（1998）以京欣1号、查理斯顿、巨人、井神小西瓜、黑崩筋5个品种的子叶为外植体，建立了西瓜品种无性繁殖系和高效培养体系，芽诱导率为46.6 %～94.0 %，其中巨人的诱导率最高，井神小西瓜和黑崩筋次之。孙治图等（2008）以23种基因型材料的西瓜无菌苗子叶为试材，运用方差分析筛选高效基因型材料。结果表明：基因型不同的材料，诱导效果有明显差异。筛选的再生高效基因型为鲁圆、三白、FW351、PM2和京母。鲁圆诱导效果最好，最高诱导率达到90.0 %；三白、FW351、PM2和京母的诱导效果次之，诱导率分别为85.0 %、82.5 %、82.5 %和80.0 %。郑先波等（2005）对无籽西瓜的成熟胚的无菌萌发条件进行了系统研究，结果表明：无籽西瓜成熟胚在无菌条件下萌发生长与品种基因型没有必然的联系，只要成熟胚在适宜的光、温、水、气条件下，均可正常萌发。

1.1.2 种子的贮藏年限 随着贮藏年限的延长，种子分化营养胚的时间相应延长，且数量少，质量差，成苗率降低；随着贮藏年限增加，种子的发芽率和发芽势降低，营养胚分化效果的差异是由于种子的活力发生变化所致（王果萍 等，1998）。王果萍（2002）采用不同贮藏年限的种子对西瓜子叶进行离体培养，结果表明：成熟子叶诱导营养胚芽丛分化试验采用贮藏1～2 a的种子，不仅发芽率高，发芽势强，而且所需培养时间短，芽丛分化率及成苗率高。

1.1.3 外植体苗龄 外植体的生理年龄也是决定离体培养能否成功的关键因素之一。马国斌等（1998）研究认为未成熟子叶和幼苗子叶是西瓜组织培养的适宜外植体（2d苗龄子叶的不定芽分化频率最高），种子萌动后只要种皮易于剥去，子叶便于切割，就可以尽量缩短子叶外植体的苗龄；宋道军等（2000）研究认为3d左右苗龄的西瓜基端子叶最易于再生。张志忠等（2004）认为苗龄对分化影响较大，但由于培养条件和基因型等差异导致不同品种的种子发育快慢不同，不宜以天数来确定苗龄，而以子叶颜色判断可能更有效，无菌苗子叶淡绿色时不定芽诱导率最高，颜色发黄或已变为深绿色的子叶分化效果较差，这与Dong和Jia（1991）、黄学森等（1994）、任春梅等（2000a）及王果萍等（2002）的报道均是一致的。

1.1.4 外植体的部位和大小 万勇等（2002）的试验研究认为带完整子叶的顶芽诱导不定芽的效果最好。林友豪等（2003）的研究表明西瓜带全子叶、带半片子叶和不带子叶上胚轴培养对不定芽的发生有影响，前二者形成的不定芽数显著多于后者。王春霞等（1996）通过京欣1号西瓜子叶组织培养试验发现，芽的分化只发生在子叶基端外植体临近下胚轴一侧的伤口边缘，而从相同子叶顶端切取的外植体则不能出芽，这与王果萍（2002）的试验结果基本上是一致的。而且，试验表明切碎的子叶由于伤口的增多、与培养基的紧密接触而容易吸收养分，诱导时间短，诱导率也高。

1.2 最适培养基的制备

培养基是组织培养的基础，含不同成分的培养基对西瓜外植体的培养会产生不同的效果。用农杆菌介导法获得转基因西瓜植株的过程中，主要用到以下几种培养基：播种培养基、预培养和共培养培养基、筛选培养基、伸长培养基和生根培养基，其中播种培养基一般为MS培养基。统计不同研究者在不同试验阶段使用的培养基类型如表1所示。

由表1可知，孙玉宏等（2007）的试验中，BM3是由MS的无机成分+100mg·L-1肌醇+1mg·L-1硫胺素盐酸盐组成，且其培养基中均附含30g·L-1蔗糖、8g·L-1琼脂、pH5.8～6.0。

表1 不同试验阶段使用的培养基类型

综合不同学者的研究发现：各位学者在其试验中均可得到不同转化率的西瓜转基因再生植株。在农杆菌介导的西瓜遗传转化体系的研究中，农杆菌侵染前，需要将外植体置于含有外源激素的培养基上进行预培养和共培养，这样可以提高遗传转化效率。另外，在培养过程中，必须在筛选培养基中添加抗生素以抑制农杆菌生长。如羧苄青霉素（Cb）、卡那霉素（Kan）、头孢霉素（Cef）等。在伸长培养基上要加入激动素（KT）、6-苄胺基嘌呤（6-BA）等细胞分裂素以促进不定芽的形成，增加繁殖系数。在生根培养基上需要加入 IAA、IBA、NAA等生长素类物质，以诱导根的生成。

2 农杆菌介导的西瓜遗传转化体系的研究

2.1 抗生素对外植体的影响

在农杆菌介导的培养转化过程中，一个很重要的环节是抑制农杆菌的生长，防止农杆菌过度增殖对植物组织细胞造成伤害和影响植株的再生，这就需要用抗生素（又称为抑菌性抗生素）及时有效地抑制，要求使用的抗生素在不伤害或少伤害受体材料的同时能完全抑制农杆菌的生长。

张志忠等（2005a）的试验表明，西瓜子叶块外植体对潮霉素（Hyg）较为敏感，15mg·L-1是适宜的筛选浓度，可明显抑制非转化组织的生长；卡那霉素（Kan）会加重外植体玻璃化，不适于西瓜不定芽的筛选；脱菌过程中，采用500mg·L-1的头孢霉素（Cef），对外植体生长影响较小；高浓度的羧苄青霉素（Cb）会使部分外植体发生水渍状现象。张明方等（2006）的研究表明，西瓜子叶外植体在Kan浓度0～125mg·L-1的浓度梯度中，芽再生率随着Kan浓度升高而降低，达到125mg·L-1时，芽再生困难。而在孙玉宏等（2007）的试验研究中发现，125mg·L-1的Kan和300mg·L-1的Cb适合于外植体筛选培养。李文兰等（2007a）的研究结果表明，氨苄青霉素、羧苄青霉素、头孢霉素3种抗生素浓度低于600mg·L-1对西瓜子叶芽分化没有明显的影响，600mg·L-1以上对西瓜子叶芽分化产生明显的抑制作用。3种抗生素中，西瓜子叶对头孢霉素的耐受性更好一些，浓度为250mg·L-1的头孢霉素有良好的抑制效果；确定潮霉素更适合西瓜转基因的选择剂，低浓度潮霉素已严重抑制根和芽的发生，20mg·L-1的潮霉素为不定芽分化适宜的筛选浓度，6mg·L-1的潮霉素即可抑制根的分化。

2.2 农杆菌菌株类型对转化的影响

农杆菌菌株直接影响转化效率，不同的农杆菌菌株有不同的宿主范围，并有其特异侵染的最适宿主。不同类型的农杆菌菌株的侵染力不同。一般而言，农杆菌菌株侵染力的顺序为：农杆碱型（琥珀碱型）菌株（A281）＞胭脂碱型菌株（C58）＞章鱼碱型菌株（Ach5、LBA4404）。选择受体植物敏感的菌株是成功转化的重要因素，对同一植物而言，不同菌株的敏感性也不同（薛建平 等，2008）。有研究者曾对不同农杆菌菌株的转化效果进行过比较，其中指出西瓜转化中的最佳农杆菌菌株为A208SE，其效果优于GV3111SE和EHA101（王关林和方宏筠，1998b）。各位学者的研究不尽相同，而张志忠等（2005a）的研究表明，对西瓜而言，农杆菌菌株EHA105的侵染能力明显优于LBA4404和AGL-1，其最高转化率可达76.7 %。

2.3 农杆菌菌液浓度对转化的影响

农杆菌的活力状态与其侵染活力有很大关系，处于对数生长期的农杆菌的活力最强，对数生长期农杆菌浓度一般在0.3～1.8 OD范围（1.0 OD≈1×109cell·mL-1）。适宜的农杆菌菌液浓度是影响转化效率的关键因素之一。浓度过低，农杆菌数不足而影响侵染效率；浓度过高，农杆菌过度繁殖又会对外植体造成伤害，从而降低转化效率。李建勇等（2007）的研究表明，农杆菌菌液OD600值为0.3左右时，其侵染效率最高，这与张志忠等（2005b）和孙玉宏等（2007）的研究结果是一致的。

2.4 侵染时间对转化的影响

农杆菌对外植体的侵染时间是遗传转化中的重要因素。适宜的侵染时间可以使较多的农杆菌附着于外植体伤口处；但时间过长，外植体在后期培养中产生褐化死亡。一般以重新悬浮后的OD600值为0.3左右的菌液侵染外植体，确定侵染的最佳时间。张志忠等（2005b）的研究显示，10min是比较适合西瓜子叶侵染的时间，这一结果与李建勇等（2007）、李文兰等（2007b）、孙玉宏等（2007）的试验结果是一致的。

2.5 预培养时间对转化的影响

外植体在用农杆菌侵染前，一般要在含有外源激素的培养基上经过一段时间的预培养，以刺激外植体细胞进行脱分化细胞分裂，而处于分裂状态的细胞可能易于感受和整合外源基因，使转化率提高。因此，预培养时间是影响植物转基因效率高低的重要因素之一。如果外植体不经预培养或预培养时间过短，在被农杆菌侵染后子叶伤口容易褐化，并且在筛选分化芽时会造成农杆菌大量繁殖，使子叶死亡。预培养时间过长，外植体的伤口处于愈合和封闭状态，也不利于农杆菌的侵染。李建勇等（2007）的试验结果表明预培养时间为2d时，西瓜子叶转化效率最高。

2.6 共培养时间对转化的影响

研究表明，农杆菌转化时，并不“侵入”到植物细胞中去，而是把T-DNA转移到植物细胞。农杆菌附着后不能立即转化，只有在创伤部位生存16 h之后的菌株才能诱发肿瘤，这一段时间称为细胞调节期。因此，共培养时间必须长于16 h（王关林和方宏筠，1998a）。共培养是农杆菌入侵子叶伤口细胞实现目的基因转化的关键。在理论上，农杆菌与植物共培养的时间越长，受侵染的细胞越多，目的基因的转化频率也就越高。但是在试验过程中发现，共培养的时间太长，农杆菌过度增殖，子叶会受农杆菌过度感染变褐而死亡，达不到转化效果；共培养时间过短，T-DNA转移过程不能完成。因此共培养时间太长或太短都不利于目的基因的转化，确定合适的共培养时间是提高转化率的关键因素之一。李建勇等（2007）在研究中发现共培养时间为3d时外植体转化效率达到最高，4d时转化效率开始下降，这与张志忠等（2005b）的试验结果相同。

2.7 乙酰丁香酮对转化的影响

Vir区基因的活化是农杆菌Ti质粒转移的先决条件。酚类化合物、单糖或糖酸、氨基酸、磷酸饥饿和低 pH都影响 Vir区基因的活化。在转基因操作过程中，最常用的诱导物是乙酰丁香酮（AS）和羟基乙酰丁香酮（HO-AS），但AS效果更佳。关于诱导剂的使用有3种方法：① 在农杆菌菌液培养时一般是制备工程菌侵染液4～6 h前加入诱导剂，也有在农杆菌制成侵染液时加入；② 诱导剂加在共培养基中；③ 在农杆菌液体培养基和共培养基中都加入诱导剂。AS的使用浓度一般为5～200μmol·L-1，培养基的 pH值为5.1～5.7，共培养温度为15～25℃，D-半乳糖酸为100μmol·L-1，葡萄糖酸为10mmol·L-1，葡萄糖为10mmol·L-1，磷酸根浓度为0～0.1mmol·L-1（薛建平 等，2008）。张志忠等（2005b）的试验发现共培养培养基中添加20mg·L-1乙酰丁香酮可显著提高西瓜子叶外植体的转化效率，最高可达74.8 %。这与一些相关研究者的试验结果是一致的（Ellul et al.，2003；Akashi et al.，2005；李建勇 等，2007）。

3 问题与展望

3.1 农杆菌介导的西瓜遗传转化存在的问题

西瓜被认为是很难利用农杆菌介导的转基因技术取得成功转化的物种，这可能是与物种的特异性有关，对农杆菌的敏感性、再生能力、芽的分化方式等因素都是转基因取得成功的关键限制因素。科研工作者一直在尝试用植物基因工程的方法来培育优良的西瓜品种（Dong & Jia，1991）。但是，许多研究表明由于西瓜再生能力较弱，且再生植株存在较为严重的玻璃化现象，而这种情况几乎无法避免（Thomas et al.，2000），并且西瓜再生植株难以直接移栽成活，移栽过程中死苗率很高（任春梅和董延瑜，2000a），是世界公认的较难用农杆菌成功转化的植物之一（王春霞 等，1996）。因此，进行西瓜的遗传转化工作较为困难。

3.2 展望

与其他方法比较，农杆菌转化系统具有操作简便、不需特殊的仪器、培养周期较短等特点，更重要的是农杆菌介导法转入的基因经常是单拷贝，因而表达水平高，并且可以转入大的dNA片段（王关林和方宏筠，1998b），因此对于大多数植物的转化工作而言是首先考虑的方法，对其在西瓜中的应用研究是有益的且是必要的。目前农杆菌介导法已应用于西瓜遗传转化的研究，并建立了西瓜子叶农杆菌介导法的遗传转化系统。

随着转基因技术的不断完善和外源基因的不断挖掘，必将在西瓜性状改良和新品种培育上发挥越来越重要的作用。因此，利用分子克隆技术提取分离或人工合成具有某一特性的基因，如改良西瓜品质基因，西瓜抗虫、抗病或抗逆性基因以及西瓜雄性不育基因等，采用农杆菌介导法或基因枪法等，将这些基因导入西瓜，可以获得利用常规育种难以得到的新种质，为西瓜育种开辟新的途径。

在进一步完善西瓜抗病品种培育的同时，其他抗逆、品质改良、控制生长发育等基因工程有待大大加强。近几年中、小果型西瓜在我国特别流行，尤其是迷你型袖珍西瓜。这些西瓜品种中普遍存在的问题则是皮薄、易裂果、不耐贮运。若能把ACC氧化酶及其反义基因导入西瓜，培育耐贮运的西瓜品种，便可使该问题得到解决。

另外，随着植物遗传转化技术的不断成熟，利用植物作为生物反应器生产药用蛋白的研究受到较高的重视，研究探索的热点之一是利用转基因植物生产口服疫苗，我国科研人员将乙型肝炎病毒表面抗原基因导入马铃薯和番茄，因此，如果能够将这些基因导入到合适的西瓜品种中（如小果型西瓜），将大大提高西瓜的附加值（艾呈祥和刘志昕，2004）。

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Research Progress on Agrobacterium tumefaciensmediatedgenetic Transformation of Watermelon

LI Juan1，LI Wan-ning2，TANG Yi1，LI Huan-xiu1*
（1College of Horticulture，Sichuan Agricultural University，Ya’an625014，Sichuan，China；2Ruraldevelopment Bureau of Shuangliu County，Shuangliu610200，Sichuan，China）

The paper introduces the present status of studies on Agrobacterium tumefaciensmediatedgenetic transformation of watermelon〔Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum. et Nakai〕，summarizes themajor influencing factors in establishing efficient regeneration system of watermelon andgenetic transformation process.The best selection of explants，the optimalmedium preparation，and antibiotics，types of Agrobacterium tumefaciens，concentration of bacteria，infecting time，pre-culture time，culture time and add acetyl clove ketone，etc are summed up.The paper alsodiscusses issues existing in watermelongenetic transformation and prospects the futuredevelopment of this system.

Watermelon；Genetic transformation；Agrobacterium tumefaciens；Review

S651

A

1000-6346（2010）08-0007-07

2009-10-21；接受日期：2009-12-31

国家科技部课题（2008BAD51BO2）

李娟，硕士研究生，专业方向：蔬菜学，E-mail：klnhlj@163.com

* 通讯作者（Corresponding author）：李焕秀，教授，博士生导师，专业方向：蔬菜学，E-mail：hxli@sicau.edu.cn