甘蔗遗传转化中不同阶段潮霉素抗性筛选

姚 丽 ，吴才文 ，曾千春

（1.云南农业大学农学与生物技术学院，昆明 650201；2.云南省甘蔗遗传改良重点实验室，开远 661600）

甘蔗（Saccharum offcinarum L.）属禾本科（Gramineae）甘蔗属（Saccharum），是重要的糖料和能源作物，蔗糖约占世界食糖总产量的70%～80%，而在我国达90%以上，甘蔗也是生产燃料乙醇和一些天然化合物的重要原料，榨汁后的蔗渣还可用于造纸[1]。甘蔗更是云南仅次于烟草的重要经济作物，也是未来重要能源作物。其遗传背景较复杂，是非整倍性异源多倍体作物，孕穗、开花及花期相遇困难，常规杂交育种难度大、周期长，新育成的高产优良品系因某一性状欠佳而不能推广应用常有发生[2]。故采用转基因技术迅速改良现有品种的研究工作日益增多，且已有了相关成功报道[3-6]，而能否成功的关键因素之一就在于能否确定适宜的筛选试剂及浓度，从而淘汰非转化体。

在农杆菌转化中，磷酸转移酶基因（hpt）一直作为有效的标记基因，其选择试剂潮霉素B（Hygromycin B，简称Hyg）与卡那霉素一样，是一种氨基糖苷类抗生素（Gritz and Davis，1983），它来源于链球菌（Streptomyces hygroscopicus），Linda等（1983）从大肠杆菌中克隆出hpt，转化到大肠杆菌和酵母菌中，得到了潮霉素抗性转化子[7]。从1989年开始hpt基因成为主要的筛选标记基因，其编码的潮霉素磷酸转移酶可将磷酸基团共价地加到Hyg的第4位上，通过酶促磷酸化作用而使Hyg失活，从而产生抗性，因此在含Hyg的培养基中，含有该标记基因的植株能存活而不含该标记基因的植株死亡。Hyg有选择效率高、基因型差异小、对转化细胞和非转化细胞区分明显、对转化细胞不产生或很少产生毒害作用，而且很少出现白化苗、再生植株的可育性也较好等优点，在水稻、玉米和小麦等作物上得到了广泛应用，是单子叶植物较为理想的筛选试剂[8-11]。因此，在甘蔗遗传转化前确定潮霉素在组织培养各阶段的使用浓度，对转化时淘汰那些未转化组织或组培苗提供了重要依据。

本试验通过观测新台糖22对Hyg的敏感性，为确定甘蔗遗传转化时各阶段的最佳抗性筛选浓度提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 材料

新台糖22，由云南省农业科学院甘蔗研究所提供。潮霉素B（Hyg）为sigma公司产品。

1.2 方法

1.2.1 培养基 （1）诱导愈伤培养基 M1：MS+2,4-D1mg/L；（2）分化培养基 M2：MS+6-BA1mg/L+NAA0.1 mg/L；（3）生根培养基M3：1/2 MS+NAA1 mg/L+蔗糖20g/L。以上培养基皆为固体培养基，未特别注明的则琼脂7g/L，蔗糖 30g/L，AC 0.2g/L，pH5.8。

1.2.2 愈伤组织的诱导 取甘蔗幼嫩叶鞘为外植体，在M1培养基上诱导胚性愈伤组织产生。

1.2.3 潮霉素抗性筛选预试验 Hyg设5个梯度，10、20、30、40、50 mg/L。将在M1中生长旺盛的胚性愈伤组织，分别接种到添加Hyg的M1、M2及M3培养基中。M1、M2培养基中每瓶接种20块愈伤组织，每块直径2～3mm；M3培养基中每瓶接种15株3～4cm高、生长健壮的无根苗。每个处理接种3瓶，设置3次重复，每5d观察记载愈伤组织生长、褐化死亡、分化及生根情况。

1.2.4 计算公式 诱导率（%）=愈伤数/接入外植体数×100；死亡率（%）=死亡愈伤（芽）数/接入愈伤数×100；分化率（%）=抗性芽数/接入愈伤数×100；生根率（%）=长根苗数/接入苗数×100。

2 结果与分析

将生长均匀、鲜黄疏松的胚性愈伤组织接种于含不同Hyg浓度的诱导培养基上，培养15d后观察统计，见表1。结果显示：Hyg对甘蔗愈伤组织影响较大，随着Hyg浓度的增高，愈伤组织死亡率也逐渐增大（见图 1、图 2）。 当 Hyg=10、20mg/L 时，愈伤组织死亡率分别为53.33%、62.22%，都有部分芽分化，分化率均为3.33%；当Hyg=30mg/L时，死亡率增至66.67%，没有芽的产生，而且40d内基本死亡；Hyg增至40mg/L时，死亡率为72.22%，30d内基本死亡；Hyg增至50mg/L时，死亡率达84.44%，死亡速度加快，30d内完全死亡（图2）。因此，甘蔗遗传转化时筛选抗性愈伤组织的Hyg浓度应为50mg/L。

2.1 潮霉素对甘蔗愈伤组织的影响

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2.2 潮霉素对甘蔗愈伤组织分化成芽的影响

由表1可看出，Hyg对甘蔗的愈伤组织的分化有更强烈的毒性作用。当Hyg=10mg/L时，有部分芽的产生，随着时间的增加分化率呈现出先增后减的趋势（图3），15d时达最大值，分化率为7.78%，愈伤组织死亡率为92.22%；当Hyg=20mg/L时，没有芽的分化，且愈伤先是暗淡松软、失水，最后逐渐褐化，死亡率增至95.56%；当Hyg=30mg/L时，10d内就几乎没有成活愈伤，15d内全部褐化死亡；当Hyg浓度增至40、50mg/L，愈伤组织10d内全部死亡。因此，质量浓度为30mg/L的Hyg可作为甘蔗遗传转化时芽分化阶段的筛选浓度。

2.3 潮霉素对甘蔗试管苗生根的影响

Hyg对甘蔗试管苗生根的梯度试验表明，Hyg对甘蔗幼苗的生根及生长也有较强的抑制作用。在不加Hyg的对照中，苗均能生根，且有主侧根、植株粗壮、叶色浓绿。当加入Hyg后，幼苗的发根及生长严重受阻，且随浓度的增加，生根率逐渐下降至零（见图4），植株细弱、叶色较淡，并逐渐黄化、枯死。

表1表明，当Hyg浓度为10、20mg/L时，均有根的生成；随着Hyg浓度增至30～50mg/L时，均没有根的生成，并逐渐黄化枯死。Hyg=10mg/L时，生根率为11.11%，60d内基本死亡；而当Hyg=20mg/L时，生根率降至3.33%，40d内基本死亡；在Hyg=30mg/L时，生根率为0，30d内逐渐黄化枯死；Hyg=40、50mg/L时，同样不能生根，30d内植株很快枯死，但与30mg/L没有显著差异。因此，Hyg浓度为30mg/L应是甘蔗遗传转化时生根阶段的最适筛选浓度。

3 讨论

本试验通过新台糖22对含不同浓度Hyg的不同培养基的敏感性，确定今后甘蔗遗传转化时的筛选浓度。试验结果表明，在相同浓度不同培养基中Hyg毒性作用不同，即在Hyg浓度为10mg/L时，无论是在诱导培养基还是分化培养基中都有芽的分化，且在分化培养基中不定芽分化率、愈伤死亡率都是诱导培养基中的两倍，生根率为11.11%；当Hyg=20mg/L时，在分化培养基中已没有芽的分化、死亡率达95.66%，而在诱导培养基中仍有芽的分化、死亡率仅为62.22%，生根率降至3.33%；而当Hyg=30mg/L时，两个阶段都已经不能分化芽，且已经完全不能生根，但在芽分化阶段，10d内就几乎没有愈伤成活，15d内全部褐化死亡，而在诱导培养基中，15d时愈伤死亡率仅为66.67%，30d左右才能将其完全致死。在同一培养基、不同Hyg浓度时其抑制作用也存在差异，如在诱导培养基中，Hyg=50mg/L在30d内才能完全抑制愈伤组织的生长及分化，并将其完全致死；而在分化培养基中，当Hyg=30mg/L时就能在15d之内完全将其致死；在生根培养基中，当Hyg=30mg/L时已经完全不能生根，并在30d内逐渐黄化枯死。

由此我们可以得出以下结论：Hyg对不同阶段培养基的敏感性存在一定差异，其毒性作用顺序是分化培养基＞生根培养基＞诱导培养基，且在甘蔗遗传转化时，在分化培养基及生根培养基中的抗性筛选浓度均应为30mg/L，而在诱导培养基中则以Hyg≥50mg/L为佳。因此，笔者认为遗传转化时可直接将Hyg=30mg/L用于分化培养基进行抗性愈伤及芽筛选试验，然后再用Hyg=30mg/L进行生根筛选，不仅节约成本，还能在短时间内及时有效的淘汰掉大部分非转化体。本研究结果为供试品种的遗传转化提供了重要依据。

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