麦冬多糖提取工艺的研究*

马丽娟,王婷婷

(宁夏大学化学化工学院,宁夏银川66865380)

麦冬多糖提取工艺的研究*

马丽娟,王婷婷

(宁夏大学化学化工学院,宁夏银川66865380)

以麦冬总多糖百分含量为指标,采用正交设计对用热水浸提醇沉法提取麦冬多糖的工艺条件进行了优选研究。在提取过程中,根据单因素实验确定了醇沉时乙醇的用量为浓缩液体积的5倍,含量测定时的最佳显色时间为15min;设计L9(33)正交实验,利用苯酚-硫酸法进行含量测定,重点考察加水量、提取温度和提取次数对提取效果的影响。结果显示提取麦冬多糖的优选工艺条件为加12倍量水,70℃水浴,提取3次,总多糖含量为67.83%。

麦冬多糖;正交试验;提取工艺;含量测定

麦冬(Ophiopogon japonicus)首载于《神农本草经》,系百合科沿阶草属多年生常绿草本植物麦冬的块根,在我国大部分地区均有野生分布和栽培,其著名产地有四川三台(川麦冬)和浙江杭州(杭麦冬)。麦冬主要化学成分为甾体皂甙、多糖、高异黄酮类、氨基酸等[1]。

麦冬多糖是从麦冬块根中提取的,总多糖由葡萄糖、果糖两种单糖组成。近年来的麦冬多糖药理作用的研究表明,作为麦冬的主要成分之一,麦冬多糖具多种药效,如具有抗心律失常,促使胰岛细胞的恢复,促进抗体、补体、溶菌酶等的产生等作用[2]。长期以来,麦冬多糖作为滋阴类中药在临床上得到广泛使用,其具有的多种药理活性已经引起人们的广泛兴趣和关注。麦冬多糖的提取工艺已有较多的研究,目前多采用的方法是用95%乙醇或甲醇加热回流提取以除去单糖、低聚糖及脂溶性成分,后加水提取其中的多糖类成分。

本实验以麦冬多糖百分含量为指标,采用热水浸提醇沉法提取麦冬多糖,设计L9(33)正交实验,根据苯酚-硫酸法[3]对其进行含量测定,重点考察加水量、提取温度和提取次数对提取效果的影响。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 麦冬:购于宁夏银川市西夏区同心路宁和医院。

1.1.2 试剂葡萄糖标准品:西安化试剂厂

苯酚(分析纯):莱阳市双双化工厂;

浓硫酸(分析纯):无锡市展望化工试剂有限公司

1.1.3 仪器植物粉碎机:天津市泰斯特仪器有限公司,型号FZ102;

数显恒温水浴锅:国华电器有限公司,HH-2型;

水循环式多用真空抽滤机:郑州长城科工贸有限公司;

721 分光光度计:上海第一分析仪器厂;

干燥箱;电子天平。

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理

将麦冬药材置于60℃干燥箱中烘干,使用植物粉碎机将其进行粉碎,密封保存备用。

1.2.2 麦冬多糖含量的测定

参照文献使用苯酚-硫酸法测定多糖含量。此法是先用葡萄糖制作标准曲线后,再通过多糖显色反应测定吸光度,然后根据其在曲线上的位置推算出多糖的浓度从而推算其含量。

1.2.2.1 标准溶液的配制

称取葡萄糖标准品0.041g,用蒸馏水将其溶解定容到100mL容量瓶中,混匀。分别精密量取该葡萄糖溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL至10mL容量瓶中,加水定容得到标准葡萄糖溶液。

表1 最大吸收波长的测定

1.2.2.2 6%苯酚水溶液的配制

称取苯酚50.0g,加铝片0.1g和碳酸氢钠0.05g,蒸馏,准确称取178℃馏分时的苯酚9g,加水150mL溶解,配成6%苯酚水溶液。置棕色瓶中保存,备用[4]。

1.2.2.3 标准曲线的绘制

量取上述2号标准葡萄糖溶液2.0mL置于干燥烧杯中,加入6%苯酚溶液1.0mL摇匀,然后加入浓硫酸5.0mL摇匀,另取上述1号2.0mL同法操作作为空白对照,于沸水浴中显色15min,取出自然冷却至室温,利用721分光光度计,在450530nm之间测定吸光度,结果在492nm处有最大吸收,因此选择测定波长为492nm。见表1。

分别移取上述标准溶液2.0mL于干燥烧杯中,分别加入1.0mL 6%苯酚溶液和5.0mL浓硫酸,摇匀。于沸水浴中恒温显色15min,自然冷却至室温,以1号为空白对照,在492nm波长处测定吸光度。以吸光度对浓度作工作曲线,得到线性方程:A=0.05757+0.01308C。见图1。

1.2.2.4 单因素实验

醇沉乙醇用量的影响 称取经粉碎的麦冬2g四份,各加入10倍量水,于70℃水浴中浸提60min,取出抽滤,滤液浓缩至10mL,分别加入95%乙醇40、50、60、70mL,静置醇沉3h。弃去上清夜,将沉淀置于 60℃烘箱中干燥 30min,取出加水溶解,于250mL容量瓶中定容,再移取1mL于另一250mL容量瓶中稀释至刻度。按标准曲线绘制项下方法测定其吸光度并计算多糖含量,结果见表2。

图1 葡萄糖标准曲线

表2 乙醇用量的影响

显色时间的确定称取经粉碎的麦冬2g四份,各加入10倍量水,于70℃水浴中浸提60min,取出抽滤,滤液浓缩至10mL,加入95%乙醇50mL,静置醇沉3h。弃去清夜,将沉淀置于60℃烘箱中干燥30min,取出加水溶解,于250mL容量瓶中定容,再移取1mL于另一250mL容量瓶中稀释至刻度。各移取2.0mL分别置于干燥烧杯中,依次加入1mL6%苯酚和5mL浓硫酸,摇匀并分别置于沸水浴中显色5、10、15、20min,自然冷却至室温,492nm波长下测定其吸光度并计算含量如表3。

表3 显色时间的影响

1.2.3 正交实验设计

选取加水量(A)、提取温度(B)、提取次数(C)作为考察因素,每个因素拟定3个水平,见表2-4,选用L9(33)正交表,实验安排见表5。

表4 因素水平表

表5 L9(33)正交设计表

1.2.3.1 多糖的提取

用天平称取9份2g粒度均匀的麦冬,分别按正交实验设计表(表2-5)的安排进行实验,实验过程中,根据单因素实验的结果,各实验项下的提取液均浓缩到10mL,醇沉乙醇用量为50mL,显色时间为15min。

1.2.3.2 含量测定

移取样品2.0mL按标准曲线绘制项下步骤操作,测定吸光度,以标准曲线计算麦冬多糖含量,结果见表6。

表6 正交实验结果

实验号 因素A B C 吸光度 麦冬总多糖含量(%) 麦冬用量(g) 6 2 3 1 0.255 47.12 2.002 7 3 1 3 0.350 67.83 2.060 8 3 2 1 0.330 64.13 2.030 9 3 3 2 0.282 51.36 2.088 K1 52.49 58.32 55.63 K2 51.05 55.58 50.30 K3 61.11 50.75 58.72 R 10.05 7.57 8.42

K1一水平试验结果总和的平均值

K2二水平试验结果总和的平均值

K3三水平试验结果总和的平均值

R:极差,反映了同一因素取不同水平时,试验结果的变化幅度,变化幅度越大,说明该因素对试验结果的影响越大,它就越重要。

以上正交试验结果表明,各因素对试验结果影响的程度依次为:A>C>B,即加水量>提取次数>提取温度。综合各种因素考虑,确定最优工艺条件为A3B1C3。

1.2.3.3 追加验证试验结果

1.2.3.3.1 重现性实验

精密量取2.0mL正交试验中7号样品溶液5份,按含量测定方法依法独立测定样品含量,以考察本法的重现性,见表7。测定的平均值结果为67.87%,RSD为0.288%。

表7 重现性实验

1.2.3.3.2 工艺条件验证实验

称取2.0g麦冬药材5份,分别加12倍量水,于70℃水浴中提取3次,每次30min,合并各份提取液并浓缩至10mL,分别加入95%乙醇50mL静置醇析,取沉淀于60℃烘箱中烘干,按照优选方案项下溶解并稀释,根据含量测定方法依次测定,其结果见表8。测得多糖得率平均值为67.55%,RSD为0.292%,表明该工艺稳定可靠。

表8 工艺验证

1.2.3.3.3 稳定性实验

取工艺验证试验中5号样品溶液2mL,按照含量测定方法操作,每隔20min测一次光度,其结果见表9,RSD为1.01%,表明测定值在120min内保持稳定。

表9 稳定性实验

1.2.3.3.4 加样回收实验

1.称取2.0g麦冬按照工艺验证步骤操作,测得吸光度为0.35,计算得第一次定容的浓度为5589.26μg/mL。

2.待加葡萄糖溶液 称取0.6g葡萄糖于烧杯中溶解,转移至100mL容量瓶中定容至刻度,摇匀备用。

3.量取第一次定容的麦冬多糖溶液0.5mL于250mL容量瓶中,加入0.5mL上述葡萄糖溶液,加蒸馏水至刻度摇匀。取5个烧杯,分别移入2mL此溶液,依法测定其吸光度,计算回收率见表10。结果均值为96.72%,RSD为2.31%。

表10 回收率实验

结果分析:在同等条件下,追加验证试验的多糖含量均无明显差异.因此优选的麦冬多糖的提取工艺条件为最佳工艺.

2 讨论

本研究主要是采用正交实验分析结果,正交实验是研究多因素、多水平的一种设计方法,它能够在因素变化范围内均衡抽样,并且使每次实验都具有较强的代表性。正是由于正交实验具备均衡分散的特点,所以保证了全面实验的某些要求,而这些实验往往能够较好或更好的达到实验目的。换句话说,只需采用较少的实验次数,即可获得最佳的方案。

据文献报道,苯酚-硫酸比色法和蒽酮-硫酸比色法为多糖含量测定的两种经典的方法。由于苯酚相对价廉,且苯酚液配制以后只要放在冰箱冷藏起来,一般不会影响测定结果[5]。故选用苯酚-硫酸比色法作为麦冬多糖的含量测定方法。

本实验优选出的麦冬多糖提取工艺条件为加12倍量水,70℃水浴,提取3次,总多糖含量为67.83%。该工艺操作简单,经济可行,为麦冬多糖热水浸提醇沉工艺的选择提供了参考。

[1]范俊,张旭.麦冬多糖药理研究进展[J].中医药学刊,2006,24(4):626-627.

[2]齐建红,陶贵荣,郭新军等.麦冬多糖的生物活性研究进展[J].西安文理学院学报:自然科学版,2008,11(1):44-46.

[3]冯怡,韩宁,徐德生等.麦冬多糖含量测定方法的研究[J].中成药,2006,28(5):705-707.

[4]王桂玲,房建强,赵雪梅等.麦冬多糖水提醇沉工艺研究[J].泰山医学院学报,2007,28(8): 603-605.

[5]吕丽娟,马明辉,贡济宇等.正交实验法优选麦冬多糖提取工艺[J].长春中医药大学学报, 2007,23(2):30-31.

[责任审校:秦春娥]

R944.1

A

1672-1047(2010)04-0026-05

10.3969/j.issn.1672-1047.2010.04.07

2010-05-27

马丽娟,女,副教授。E-mail:malj@nxu.edu.cn.