大白菜缘枯病抗性基因的SRAP标记筛选

邸 青 张淑江 章时蕃 李 菲 孙日飞

（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

大白菜缘枯病抗性基因的SRAP标记筛选

邸 青 张淑江 章时蕃 李 菲 孙日飞*

（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

以大白菜缘枯病抗病材料山西信中籽-339和感病材料山西信中籽-332为亲本构建包含 111个单株的F2分离群体，利用SRAP分子标记技术并结合分离群体混合分析法（BSA）筛选与抗病基因连锁的标记。结果表明：在 672对 SRAP引物中有 19对引物在抗感病池间存在多态性，经过单株筛选，BMe10CO11标记与大白菜缘枯病抗病基因连锁，其遗传距离为11.4 cM。

大白菜；缘枯病；SRAP标记

大白菜〔Brassica campestrisL. ssp.pekinensis（Lour）Olsson〕起源于中国，是十字花科芸薹属中重要的蔬菜作物之一。近年来在大白菜种植过程中出现了一种新型病害，该病害多发生于北方秋季，始发于早秋，随着时间的推移，病情逐渐加重，直至植株死亡。染病初期多数叶片叶缘焦枯，随着病情发展，由叶缘随叶脉向基部扩展，叶脉、叶柄失绿、枯黄，最终全株干枯死亡。迄今，其病原物尚未分离出，也未见相关文献报道这一病害，根据该病害发病症状，暂定名为缘枯病。该病一旦发生，将导致大白菜减产甚至绝产，造成极大的经济损失。选育抗缘枯病的品种是保持大白菜生产稳产高产的重要措施，利用分子标记辅助选择抗病品种是经济有效的育种途径之一。

目前，分子标记辅助选择已广泛应用于园艺作物育种方面（张剑侠 等，2001；姬广海 等，2004；孟芳 等，2007）。在大白菜病害方面常用的分子标记主要有 AFLP、RAPD、SSR等（王美 等，2003；韩和平 等，2004；冷月强 等，2007）。SRAP标记即相关序列扩增多态性（Sequence-relate amplified polymorphism）是一种基于PCR的新型标记系统，试验操作过程简单，扩增条带清晰，结果稳定，是一种兼有AFLP、RAPD和SSR标记的优点，同时又克服了它们一些缺点的分子标记（任羽 等，2004）。

由于SRAP标记多态性高、重复性好、在基因组中分布均匀等优点已被广泛应用于遗传多样性分析、比较基因组学、图谱构建等方面（Riaz et al.，2001；Ferriol et al.，2003；林忠旭 等，2003）。Li和Quiros（2001）用SRAP标记研究了大白菜、油菜、芹菜，获得了雄性不育基因、1个CMS育性恢复基因和1个抗病毒基因的SRAP标记。目前SRAP技术尚未应用到大白菜抗病性的标记中。

本试验在田间自然鉴定的基础上，通过SRAP标记技术筛选与大白菜缘枯病抗性基因紧密连锁的分子标记，既可用于大白菜缘枯病抗性的辅助选择，同时也为缘枯病抗性基因的精细定位及克隆奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料均由中国农业科学院蔬菜花卉研究所白菜课题组提供。根据本课题组3 a田间鉴定所确定，以高抗缘枯病材料早熟深绿色束心类型山西信中籽-339（简称 339，下同）、山西信中籽-331、山西信中籽-338，高感缘枯病材料早熟深绿色束心类型山西信中籽-332、山西信中籽-340分别为亲本，配制杂交组合339×332、331×332、338×340。3个杂交组合后代自交构建F2分离群体，进行抗病性遗传学分析。

利用339×332组合构成的F2群体，包含111个单株，其抗性出现3∶1分离，此群体用于连锁分析。

1.2 方法

1.2.1 抗病性鉴定 于 2009年秋季田间露地定植亲本、F1及 F2分离群体，使其自然发病，在发病过程中共进行4次调查（9月18、28日，10月8、18日），调查间隔时间相同。根据大白菜叶片干枯程度判定单株对缘枯病的抗性。当大白菜由内向外整株干枯时，表现高感；只外叶叶缘少量干枯，外叶有少量褐色斑点，为中抗；整株没有干枯叶，为高抗（图 1）。用χ2测验法检验所得F2抗感分离比例的适合度。

1.2.2 基因组DNA提取及建池 大白菜田间定植7 d后、发病前采集单株叶片，冻干磨成粉末，利用改良CTAB法提取亲本、F1、F2单株基因组DNA（Wang et al.，2005），利用Nanodrop ND1000检测DNA浓度及纯度，并将DNA浓度稀释为40 ng·μL-1，-20 ℃保存备用。根据田间鉴定结果，分别选取高抗单株10株构成抗病池，高感单株10株构成感病池。

图1 大白菜缘枯病病情分级标准

1.2.3 SRAP反应体系 所有引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。用于分析的SRAP引物来源于十字花科作物、水牛草、黄瓜、棉花等，合成正向引物25条、反向引物32条（Li & Quiros，2001；Riaz et al.，2001；Lin et al.，2003；Budak et al.，2004；Wang et al.，2005）。用抗、感病池对SRAP引物进行筛选，挑选能够产生特异性条带的引物，再对F2分离群体单株进行扩增。

SRAP-PCR反应体系：在20 μL反应体系中，16 ng·μL-1DNA 8 μL，10×Buffer 2 μL，0.2 mmol·L-1dNTP 1.6 μL，0.75 ng·μL-1引物 1.5 μL，0.05 U·μL-1Taq 酶 0.2 μL，其余用蒸馏水补齐。PCR扩增程序：94 ℃预变性3 min，接着94 ℃变性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，5个循环；然后将退火温度变为50 ℃，35个循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。扩增产物在8 %聚丙烯酰胺凝胶上电泳，然后进行银染显色。

1.2.4 连锁分析 根据亲本与F1的带型，统计F2单株带型，用Joinmap 4.0软件进行目的基因和分子标记位点的连锁分析。

2 结果与分析

2.1 田间鉴定遗传分析

田间调查结果表明（表1），339×332 F1群体发病率23 %，死亡率0；F2群体发病率57 %，死亡率26 %，抗感比值2.82，P值为0.56，χ2值为0.34，在0.05水平下（χ20.05=3.841）实际值与理论值差异不显著。331×332 F1群体发病率15 %，死亡率0；F2群体发病率60 %，死亡率23 %，抗感比值为3.28，P值为0.22，χ2值为0.63，在0.05水平下实际值与理论值差异不显著。338×340 F1群体发病率0，死亡率0；F2群体发病率50 %，死亡率19 %，抗感比值4.27，P值为0.13，χ2值为2.25，在0.05水平下实际值与理论值差异不显著。

3个组合的F1发病率均较低，死亡率全部为0，即F1全部表现为抗病，F2群体出现抗感分离，经χ2检验，在0.05水平下3个群体的抗感分离比值与理论值差异不显著，3个F2群体的抗性全部表现为近似3∶1的分离比，符合显性单基因控制模型。可以得出：鉴定的3个大白菜这3个群体对缘枯病的抗性是由1个显性基因控制。

表1 田间调查抗感遗传规律

2.2 与缘枯病抗病基因连锁的SRAP标记

利用抗、感病池对672对SRAP随机引物进行筛选，平均每对引物产生条带8.9条。筛选到与缘枯病抗性基因连锁的标记 1个，命名为BMe10CO11，标记片段长度约160 bp（图2）。在 F2分离群体 111个单株中验证 BMe10CO11的多态性（图3）。

2.3 遗传连锁分析

根据田间鉴定结果，筛选出的 82个抗病单株中，74个有标记条带，8个没有标记条带；29个感病单株中，18个没有标记条带，11个有标记条带。在这 111个单株中，共有19个发生了重组（表2）。用Joinmap 4.0软件分析，BMe10CO11与抗缘枯病基因间的遗传距离是11.4 cM（图4）。

图2 引物B10CO11对亲本和F1的扩增结果

图3 引物BMe10CO11对亲本和F2部分单株的扩增结果

表2 F2分离世代目标条带分离结果

图4 遗传连锁图

3 结论与讨论

本试验对亲本、F1、F2群体在发病期进行田间鉴定，根据植株干枯程度判定单株抗性，并通过χ2检验适合度，发现F2群体对缘枯病的抗性是由1个显性基因控制。并采用SRAP标记技术结合BSA法对缘枯病抗性基因进行标记，在 672对 SRAP引物中获得 1个与目标基因间距为11.4 cM的SRAP标记BMe10CO11。

SRAP标记是针对基因外显子里GC含量丰富，而启动子、内含子里AT含量丰富的特点来设计引物进行扩增，因不同个体的内含子、启动子与间隔区长度不等而产生多态性（Li & Quiros，2001）。SRAP标记以其简单、稳定、共显性、在基因组中分布均匀的优点，已成功应用于多个物种中。本试验应用SRAP标记技术，筛选到1个与抗缘枯病基因连锁的标记。理论上可以用抗病材料与遗传背景良好但不抗缘枯病的优良自交不亲和系作为亲本进行杂交，得到的F1在苗期用该标记选择抗缘枯病基因的单株，再用该优良自交不亲和系作为轮回亲本连续回交，经6～7代选择，就可育成含有抗缘枯病基因的新优良自交不亲和系材料，加快了育种进程。

此外，为了进一步提高试验的重复性及稳定性，可以回收SRAP标记的特异性条带，进行挖带、克隆、测序，并根据测序结果设计更长的寡核苷酸引物对，将其转化为SCAR标记。

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孟芳，袁庆华，苏德荣，高建明．2007．紫花苜蓿抗褐斑病ISSR分子标记研究．草地学报，15（6）：562-565.

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Screening of SRAP Marker Linked to Marginal Leaf Scorch Resistance Gene in Chinese Cabbage

DI Qing, ZHANG Shu-jiang, ZHANG Shi-fan, LI Fei, SUN Ri-fei*
（Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China）

The segregating population was developed from a cross between a resistance Chinese cabbage（Brassica rapaL. ssp.pekinensis）339 and the susceptible 332. The molecular marker techniques SRAP and bulked segregation analysis（BSA）were used to screen markers linked to the disease resistance genes. Among the 672 primer combinations, BMe10CO11 showed polymorphism between bulks of resistance and susceptible. The distance of BMe10CO11 was 11.4 cM.

Chinese cabbage; Marginal scorch; SRAP marker

S436.341.1+9

A

1000-6346（2010）16-0021-05

2010-04-14；接受日期：2010-06-18

农业部园艺作物遗传改良重点开放实验室项目，国家“十一五”科技支撑计划项目（2006BADBB06-4-6，2008BADB1B01-1），公益性行业（农业）科研专项（nyhyzx07-007）

邸青，女，硕士研究生，专业方向：蔬菜遗传育种，E-mail：ayoula114@yahoo.com.cn

* 通讯作者（Corresponding author）：孙日飞，研究员，博士生导师，专业方向：蔬菜遗传育种，E-mail：rifei.sun@caas.net.cn