抗风湿颗粒对佐剂性关节炎大鼠免疫功能的影响

杨 锋 李彦民 李引刚 窦群立 陕西中医学院附属医院骨科创伤病区(咸阳 712083)

抗风湿颗粒来源于陕西省名老中医李彦民主任医师经验方—抗风湿汤,经现代工艺技术改进剂型制成的颗粒剂。此方在 20多年治疗寒湿阻络型痹病中取得了满意的临床效果[1]。本实验是进一步观察本方对实验动物免疫功能的影响,为临床治疗痹病提供一定的实验依据。

1 实验材料及方法 1.1 实验动物 合格成年 SD大鼠 48只,雌雄各半 ,体重 160± 2g,由西安交通大学医学院实验动物中心提供,动物质量合格证书号:医动字第 08— 005号。

1.2 实验用药及主要试剂 1.2.1 抗风湿颗粒:由威灵仙、秦艽、细辛、穿山龙、制川乌、乌梢蛇等组成。大鼠用量按文献方法折算[2],配制成不同浓度溶液 ,大剂量每 mL含生药 5.4g,中剂量每 mL含生药 1.8g,小剂量每 mL含生药 0.6g。

1.2.2 雷公藤多甙片:鲁南制药股份有限公司 国药准字Z37020344。 10%绵羊红细胞悬液 ,由宝泰克生物制品有限公司提供。豚鼠补体:第四军医大学免疫实验室制备。完全弗氏佐剂 CFA,由北京鼎国生物制品公司出品。

1.3 实验分组及给药 全部大鼠购回后适应性喂养 1周,然后随机分为 6组,每组 8只,A组正常组,B组模型组,C组雷公藤多甙组,D、E、F分别为抗风湿颗粒小、中、大剂量组。于 B、C、D、E、F五组大鼠每只右后足足垫皮内注射 0.1mL CFA。造模成功后,每组每日灌胃 1次,A、B组灌生理盐水 2mL/只,C组灌雷公藤多甙混悬液 2mL/只(0.6g/mL),D、E、F分别给抗风湿颗粒小、中、大剂量 2mL/只,连续 30d。

1.4 试验方法 1.4.1 淋巴细胞转化率:末次给药后前 3d,每只大鼠腹腔注射 ConA0.3～0.5mg。 3d后,通过摘除大鼠眼球采集外周血,加入预先加有肝素的试管中。取 1小滴抗凝血滴在玻片中央,用推片将血液涂开。自然干燥。取甲醇 1～2滴滴在涂片上,自然干燥。加姬姆萨或瑞氏染液 2滴于涂片上,同时加 2滴水,用吸管水平涂开,使染液均匀覆盖涂抹面,染色时间为 5～10min。自来水细水冲洗染液,然后用吸水纸轻轻吸干玻片上的液体。显微镜观察结果,计数淋巴转化细胞,计算转化率。转化率=转化的淋巴细胞数 /(转化的淋巴细胞数+未转化的淋巴细胞数)×100%。

1.4.2 抗风湿颗粒对大鼠巨噬细胞吞噬功能的影响:指标检测 末次给药后 24h尾静脉注射印度墨汁(用生理盐水 1:1稀释)0.1mL,注射后 lmin,5min眶内采血各 1次,加入到 2mL的0.1%Na2CO3溶液中摇匀。用 721型分光光度计在 680nm下测光密度值 OD。第 2次采血后处死动物,取肝脾称重,计算吞噬指数 K及吞噬系数α K= (logOD1-logOD5)/t5-t1=(logOD1/OD5)/4,α=体重 /肝脾重×K1/3。Ⅲ 抗风湿颗粒对特异性体液免疫功能的影响。

1.4.3 溶血素水平:给药第 1d,用 10%绵羊红细胞 0.2mL/只,给大鼠腹腔注射进行免疫,末次给药后 24h眼眶采血 ,分离血清,倍比稀释(500倍以上),反应管内依次加入经稀释的血清1mL,5%的绵羊红细胞 0.5mL,10%的补体 1 mL置 37℃,恒温水浴中保温 30min,然后移至冰浴终止反应,1500r/min离心5min取上清液 1mL,加入都氏试剂 3mL,可出现棕色,摇匀放置 10min,于 540nm波长下比色,读取吸收度。然后测 SRBC半数溶血值:取 5%SRBC加入都氏液至 4mL,比色读取吸光度值,即为实验中所用 SRBC半数溶血时的吸光度值。样品管中溶血值 CH50计算式为:每只大鼠的血清 CH50=样品吸光度值 /SRBC半数溶血时的吸光度值×稀释倍数

1.5 统计学方法 采用 SPSS10.0软件进行统计学处理,结果用均数±标准差()表示,多个组比较用单因素方差分析,组间多重比较用 LSD-t检验,检验水准取双侧 α=0.05。

2 实验结果

表1 抗风湿颗粒对 AA大鼠淋巴细胞转化率的影响

表2 抗风湿颗粒对巨噬细胞吞噬功能的影响

表3 抗风湿颗粒对大鼠溶血素水平的影响

表4 大鼠胸腺、脾脏指数(mg/100g体重)

从表 4可以看出:①胸腺指数:雷公藤多甙组与空白组比较有统计学意义,P＜0.05。抗风湿颗粒中、小剂量与空白组比较无统计学意义 P＞0.05.抗风湿大剂量则显著降低胸腺指数,P＜0.05。②脾脏指数:雷公藤多甙组与其余各组比较有统计学意义 P＜0.05。抗风湿颗粒大、中、小剂量与空白组比较无统计学意义 P＞0.05。

讨 论 抗风湿颗粒对 T淋巴细胞转化率的影响淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的细胞免疫水平,因此可作为测定机体免疫功能的指标之一。本试验采用形态计数法读取 T淋巴细胞转化率。从实验 1.4.1可以看出:雷公藤多甙组与其它各组比较有统计学意义(P＜0.05)即雷公藤多甙可显著降低大鼠淋巴细胞转化率。抗风湿颗粒大剂量组与模型组比较有统计学意义(P＜0.05),与雷公藤多甙组比较无统计学意义(P＞0.05)即:抗风湿颗粒大剂量明显降低大鼠淋巴细胞转化率。这表明抗风湿颗粒大剂量可明显抑制大鼠细胞免疫功能。中小剂量组对淋巴细胞转化率无明显影响。

对非特异性屏障机能的影响 巨噬细胞作为机体天然免疫的组成部分,不仅对机体的屏障机能起着重要作用,并且参与免疫应答,还可产生多种生物活性物质,即:各种细胞因子和激素样物质 ,如:IL-l、 TN F-α、 IFN、PGE2、C、 NO 、溶菌酶等。在产生特异性细胞免疫和体液免疫之前发挥防御作用。本实验中胶体碳颗粒(印度墨汁 )进入血循环后,迅速为单核巨噬细胞所清除,其中主要为定居在肝和脾脏的巨噬细胞所吞噬。肝脏Kupffer细胞摄取约 90%,脾脏巨噬细胞约 10%。若将异物量恒定,则自血流中摄取的速率可以反映吞噬细胞的吞噬功能。以血碳浓度对数值为纵坐标,时间为横坐标,两者呈直线关系,此直线斜率 K可表示吞噬速率。因动物肝脾重量不等,K值亦不同,故以校正的吞噬指数α[3]表示。从实验 1.4.2可以看出:雷公藤多甙组与其它各组比较有统计学意义(P＜0.05)即雷公藤多甙可显著降低大鼠巨噬细胞吞噬血中胶体碳粒的速度。抗风湿颗粒各组与模型组比较无统计学意义(P＞0.05)即:抗风湿颗粒对大鼠巨噬细胞吞噬功能无明显影响。这表明抗风湿颗粒不影响非特异性屏障机能。

对特异性体液免疫的影响本实验中绵羊红细胞致敏的大鼠血清中的循环抗体—溶血素(IgM)与绵羊红细胞一起在补体参与下产生溶血反应。血清中溶血素含量可以通过溶血过程中释放的血红蛋白量来检测。从实验 1.4.3可以看出抗风湿组与模型组比较无统计学意义(P＞0.05)即:抗风湿颗粒对特异性抗体生成无明显影响。

对免疫器官的影响胸腺是诱导 T淋巴细胞分化成熟的重要器官。 T淋巴细胞担负着机体的细胞免疫功能,并参与免疫应答的调节,所以胸腺功能缺陷能引起细胞免疫功能的下降及对某抗原的抗体产生受损。胸腺重量可以间接反映它的功能[3]。脾脏可以分化出淋巴细胞,它是产生免疫应答的场所,它含有更多的 B细胞和浆细胞,因此在抗体生成中起重要作用。徐立[4],许得盛[5]等在实验中应用胸腺指数、脾脏指数反映药物对这些免疫器官的影响。胸腺、脾脏指数增大,提示药物有免疫促进作用。反之有免疫抑制作用。从表 4可以看出:①胸腺指数:抗风湿颗粒中、小剂量与模型组比较无统计学意义 P＞0.05。抗风湿大剂量则显著降低胸腺指数,P＜0.05。②脾脏指数:抗风湿颗粒大、中、小剂量与模型组比较无统计学意义 P＞0.05。雷公藤多甙组显著降低胸腺、脾脏指数,即有广泛抑制免疫器官及免疫器官萎缩作用。抗风湿中、小剂量对免疫器官无明显作用。大剂量对中枢免疫器官有抑制作用,对外周免疫器官则无影响。

现代药理研究显示,以上诸药均有不同程度的抗炎及免疫抑制效应[6]。同我们实验中复方颗粒剂的实验结果基本一致。总体来看,抗风湿颗粒具有选择性抑制细胞免疫的作用,对于特异性体液免疫和非特异性屏障机能无明显作用。这对于抗风湿药物来说是具有积极意义的,它可以避免广泛的免疫抑制所带来的副作用。

[1]焦百乐 ,李引刚,李彦民.抗风湿汤治疗寒湿阻络型痹病临床研究 [J].现代中医药,2003,23(5):10.

[2]徐叔云.药理实验方法学 [M].北京:人民卫生出版社,2002:157.

[3]吴敏毓.医学免疫学 [M].北京:人民卫生出版社,2000:205.

[4]徐 立.血红林蚂蚁粉抗炎、镇痛作用的实验研究[J].南京中医药大学学报 ,1997,13(4):213.

[5]许得盛.类风关合剂治疗类风湿性关节炎的临床及实验研究[J].中国中西医结合杂志,1996,(1):14.

[6]丁光霞,胡定华,李菊仙.川附子水溶性提取物对“阳虚”小鼠免疫功能的影响 [J].陕西中医,1985,6(7):299.