水稻OsTIR1启动子的克隆及植物表达载体的构建

龚 蓉 ，钟菲菲 ，2，黄志刚

（1.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.长沙市食品质量安全监督检测中心，湖南 长沙 410018）

生长素（auxin）是最早被发现的一类植物激素，参与调控植物生长和发育的许多方面[1-3]。水稻生长素作用机制的研究对于揭示超级杂交稻超高产机理并指导育种工作具有重要意义。在生长素受体的发掘过程中，科学家先后发现了两种能与生长素发生特异性结合作用的蛋白质，生长素结合蛋白ABP1[4]与生长素受体蛋白TIR1[5]，但随后的证据表明ABP1并不是真正的生长素结合蛋白[6-7]。因此，作为发现的第一个生长素受体，TIR1在生长素作用机制的研究中有着关键的意义。随着研究的不断深入，TIR1在信号转导机制上的作用逐渐清晰[8-9]，使得研究者迫切地想了解植物体内TIR1的表达调控机制。真核基因表达调控一直是近代分子生物学的一个研究热点，转录水平的调控，是众多基因表达调控方式中最直接、最有效的。启动子是指基因中一段可与RNA聚合酶及其它一些影响转录的反式因子结合实现准确有效起始转录的DNA序列[10]。作为一种重要的基因表达调控的顺式元件，在转录水平调控过程中起着关键作用，因此启动子的分离及功能分析不仅是植物基因表达调控研究的重要内容，也是植物基因工程研究的一个重要方面。

本研究拟基于生物信息学方法从超级稻株1 S中克隆OsTIR1的启动子，并对水稻TIR1启动子基因功能元件进行分析，将该启动子与GUS基因融合，于转基因植物中分析启动表达的时空特异性及表达强度，为进一步深入研究水稻TIR1的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

超级杂交水稻（Oryza sativa L.）母本株1S由湖南亚华种业科学研究院提供。转化受体菌E.coli DH 5α，带CaMV 35 s启动子的GUS基因的质粒PBI 121均由本室保存。T4 DNA连接酶、限制性内切酶 Xba I和 Hind III、LA Taq DNA 聚合酶、GC buffer和pMD19-T载体购自TaKaRa公司。质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒购自安比奥公司。PCR引物合成，测序均由上海英骏生物技术有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 水稻基因组DNA的提取 水稻种子在25℃条件下发芽，幼苗长到3～4片叶时，采用CTAB法小量提取水稻幼苗叶片基因组DNA。

1.2.2 TIR1启动子的PCR扩增 根据GenBank上已报道的TIR1基因cDNA的全长序列，设计了克隆TIR1基因启动子序列的上下游引物，为了便于定向克隆和载体构建，在上游引物和下游引物的5′端分别引入Xba I和Hind III酶切位点：

上游引物5'-GCAAGCTTACAAATCGAGAACCAAGA-3'

下游引物 5'-ATTCTAGACATGCTGCAACGGATCG-3'

划线部分为引入的酶切位点。以水稻基因组DNA为模板，在上述特异性引物的作用下，进行PCR扩增。PCR扩增反应体系为20μL：DNA模板2μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL，dd H2O 5.4 μL，2×GC Buffer 10 μL，dNTP 0.4 μL，La Taq DNA聚合酶0.2μL。PCR参数为：94℃预变性5 min，94℃变性 45 s，54℃退火 40 s，72℃延伸 2.5 min，27个循环，72℃延伸10 min。

PCR反应完成后，在1%的琼脂糖凝胶上电泳检查扩增片段的特异性和大小，然后将含有目的片段的胶块切下，用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收纯化。

1.2.3 TIR1启动子的克隆与重组子的鉴定 将回收后的目的片度与pMD19-T载体连接，转化大肠杆菌DH 5α感受态细胞，将转化产物涂布在含有卡那霉素（Kan）LB培养基平板上筛选转化子。提取白色单菌落的质粒DNA，用PCR扩增和Hind III/Xba I双酶切两种方法鉴定，构建的重组质粒命名为pMD19-pTIR1。将鉴定正确的转化子送上海英骏生物技术有限公司测序确证。

1.2.4 植物表达载体的构建 将阳性克隆质粒用Xba I和Hind III双酶切后，同时用相同的限制性内切酶将植物表达载体PBI 121上CaMV 35 S启动子切除，回收相应的酶切片段，在T4连接酶的作用下将TIR1启动子酶切片段与PBI 121酶切产物16℃连接过夜，转化DH 5α感受态细胞，涂布于含卡那霉素（Kan）抗性的LB平板上，37℃培养过夜，挑单菌落培养，提取质粒进行PCR和双酶切鉴定，构建的植物表达载体命名为PBI121-pTIR1。

2 结果与分析

2.1 OsTIR1启动子序列的扩增

以超级杂交稻基因组DNA为模板，用设计的特异性引物进行PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，得到一条长度约为1 500 bp的特异条带（图1），该片段与预期片段大小基本相符。

2.2 OsTIR1启动子序列的克隆与序列分析

将PCR产物回收纯化后，将纯化的目的片段克隆入pMD19-T载体后，经PCR扩增和Xba I和Hind III双酶切后得到的片段与PCR结果相吻合（图2）。测序结果显示该片段包含1 530个核苷酸，与NCBI中的TIR1基因的启动子序列比对后无突变。

图2 质粒pMD19-pTIR1双酶切鉴定

图1 TIR1启动子PCR扩增

采用植物顺式元件分析软件PLACE和Plant－Care软件分析所克隆到的OsTIR1基因启动子序列，发现其中含有大多数高等植物启动子的保守元件，说明它具有潜在的启动子活性。其中预测发现了多个具有启动子的基本转录元件13个TATA-box和10个CAAT-box，进一步分析发现该启动子序列还包含多个特异性调控元件，包括11个与光应答相关的启动子序列元件，如AE-box，CATT-motif，G-box，GAG-motif，GT1-motif等。此外，还发现 1 个厌氧诱导所需的顺式调控元件ARE和3个昼夜节律调控元件Circadian等，序列分析如图3所示。

图3 TIR1启动子序列及其结构

2.3 植物表达载体PBI121-pTIR1的构建

重组质粒pMD19-pTIR1用Xba I和Hind III双酶切后，回收目的片段，与经同样酶切的PBI 121植物表达载体连接，从而使TIR1启动子替换表达载体上的CaMV 35 S启动子。将连接产物转化DH 5α，经PCR扩增和双酶切鉴定均可见约1 500 bp的目的片段（图4），表明成功地构建了PBI121-pTIR1植物表达载体。

图4 质粒的双酶切鉴定

3 讨论

生长素是植物生长发育中起关键作用的植物激素，生长素受体作为研究生长素信号传导链的最重要环节，研究它的高表达调控机制具有重大的意义。到目前为止，生长素信号转导途径并没有明朗，比如生长素是怎样促进T1R1-Aux/IAA相互作用的，生长素与Aux/IAA之间的关系问题等。分离TIR1启动子基因，有助于从基因水平上对生长素信号转导的研究。

本实验成功克隆了水稻TIR1基因的启动子，经 PLACE（http://www.dna.afrc.go.jp/PLACE/signalscan.htm）分析后发现：在该片段中存在多个顺式作用原件如ARE及多种光响应元件如GATA-motif、G-box和CATTmotif等这些都是在光诱导表达启动子中的保守元件，能够调节基因受光诱导后的转录活性。Reyes[11]研究表明，在植物中，GATA-box在光诱导和硝酸盐诱导基因的转录过程中起作用；另外还存在多个增强子系和广东省有一定恢复力的常规品种，结实率低于50%的组合2个，低于60%的2个，感光的1个，其余均在70%以上，恢复比例97.7%，表现突出的有盛泰A/0510，结实率86.3%，单株重35.8克，比同条件对照金优207增产12.3%，比同父异母组合岳4A/0510增产8.7%；在品种比较试验中，盛泰A/岳恢9113平均产562.8 kg/667m2，比岳优9113增产5.86%。

综合3 a配合力测定情况，盛泰A恢复谱比较广，在恢复材料范围内，恢复比例达到96.5%，多数类型恢复结实达80%以上。其配制的盛泰A/9712、盛泰 A/E318、盛泰 A/9264、盛泰 A/9722、盛泰 A/R018、盛泰A/C402分别进入多个省级区试的续试和初试。

2.7 繁殖制种性状

2007年一季小量繁种，8月3日始穗，花期处于高温条件下，53.3 m2繁殖收种17 kg，折合产212.5 kg/667m2。2008年小量制种，在岳优9113制种基地，盛泰A制100 m2，收种38.5 kg，折合产256.7 kg/667m2，随机取样调查，异交结实61.3%，比同条件下的岳4A高8.2个百分点，表现出良好的异交结实特性。

3 小结

经3 a试验研究，盛泰A农艺性状稳定，花粉败育彻底，败育率100%，典败率99.93%；自交结实率0.027‰；开花习性好，平均花时为10:38，午前花率76.3%，花时较岳4A早13 min，开颖角度30°18′；柱头外露率83.8%，异交结实性好，良好情况下，一般结实可达60%以上；播始历期67～86 d，可进行春制和秋制。特别是盛泰A不育系米质优，米质遗传力强，一般配合力好，配组子一代依据父本熟期，可作中迟熟连晚和一季晚稻栽培。盛泰A不育系多个组合在省级区试中表现突出，在高档优质杂交稻研究上有广阔的应用前景，建议加速该不育系的开发应用。

[1]蒋逊平，谢晓阳，欧光辉.新质源优质不育系岳4A的选育与应用[J].杂交水稻，1999，14（2）：3-5.

[2]蒋建为，蒋逊平，谢晓阳，等.优质杂交水稻新组合岳优9113的选育[J].湖南农业科学，2005，（2）：9-11.

[3]蒋逊平，谢晓阳，张 胜，等.籼型优质新不育系丝苗A特征特性研究[J].湖南农业科学，1999，（2）：14-16.

[4]蒋建为，欧阳光辉，夏照明，等.新组合新香优9113的选育与栽培技术研究[J].湖南农业科学，2008，（5）：18-19.

[5]程式华，李 健.现代中国水稻[M].北京：金盾出版社，2007.