超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法快速分析烟草中7种潜香物质

吴新华,朱瑞芝,王 凯,任卓英,牟定荣,魏万之,缪明明

(1.红塔烟草(集团)有限责任公司技术中心,云南玉溪 653100; 2.昆明理工大学,云南昆明 650224;3.湖南大学化学化工学院,湖南长沙 410082; 4.云南烟草科学研究院,云南昆明 650106)

超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法快速分析烟草中7种潜香物质

吴新华1,2,朱瑞芝1,3,王 凯1,3,任卓英1,牟定荣1,魏万之3,缪明明4

(1.红塔烟草(集团)有限责任公司技术中心,云南玉溪 653100; 2.昆明理工大学,云南昆明 650224;3.湖南大学化学化工学院,湖南长沙 410082; 4.云南烟草科学研究院,云南昆明 650106)

使用超高效液相色谱-电喷雾串联四极杆质谱(UPLC-ESI-MS/MS)在多反应离子监测(MRM)模式下分离鉴定了烟草中7种潜香物质。烟样经甲醇提取,XAD-2柱分离纯化,选择中性丢失162 u扫描确定母离子。通过对母离子二级质谱扫描(MS2),并根据m/z192.7、179.2、163.1、134.7、133.2等特征碎片离子峰分析结果确定了7种潜香型物质,分别为熊果苷、香豆酸-葡萄糖苷、香豆素奎尼酸、新绿原酸、绿原酸、葡萄糖基阿魏酸、3-氧化紫罗兰醇葡萄糖苷。

烟草;潜香物质;超高效液相色谱-质谱联用

Key words:tobacco;aroma precursors;ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry interfaced with electro-spray ionization(UPLC-MS/MS)

卷烟香吃味是烟草品质的重要体现,因此对于烟草香味成分的分离、鉴定和分析一直以来都是烟草研究的重要领域。其中潜香物质是烟草香气组成的重要部分,包括有机酸、多酚(主要以葡萄糖苷和酯的形式存在)等。这些化合物在烟叶生长发育过程中形成,其本身不具有香气特征,但在烟草成熟、调制、醇化和燃烧过程中,可释放出香气物质,从而对烟气香味产生贡献。潜香物质在烟草调香过程中具有重要作用,对烟草等级、烟气特征、吸食品位都有重要的影响[1]。

目前对容易获得标样的潜香物质的分析方法主要有液相色谱法[2-4],而对于很难获得对照品的潜香物质,如糖苷物质,其分析方法主要有以下3种:1)先衍生化处理,再使用气相色谱-质谱联用的方法进行分析[5];2)先将糖苷粗提物酶(水)解,然后用气相色谱法或气相色谱-质谱联用法分析糖苷酶(酸)解后的苷元,对糖苷结合态香味成分进行定性定量分析[6-8];3)分离纯化,结合核磁分析和气相色谱进行定性定量分析[9]。以上对于难以获得标样的糖苷类潜香物质的分析方法,均存在前处理复杂、分析周期长等缺点,本工作通过UPLC-ESI-MS/MS的中性丢失扫描,采用多反应离子监测(MRM)模式,分离鉴定烟草中的7种潜香物质。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

AcquityTM超高效液相色谱仪:美国 Waters公司产品;API 3200 QTrap串联三重四极杆线性离子阱质谱仪:美国ABI公司产品;Millipore超纯水仪:美国 Millipore公司产品;Branson 3510超声波发生仪:Branson公司产品。

甲醇(色谱纯):美国Fisher公司产品;水为去离子水;其他有机试剂均为分析纯。2007年产玉溪 KC3FG 46-2-3烤烟样品:由红塔集团提供。

1.2 样品处理

1.2.1 潜香物质的分离 准确称取10 g烟样(过80目筛)于锥形瓶中,加入100 mL甲醇超声萃取1 h,萃取液过滤浓缩至干,加入100 mL水溶解过XAD-2柱,先用400 mL水洗去酸、碱和糖等;再用300 mLV(乙醚)∶V(正己烷)= 1∶1的溶液洗去游离香味物质和油脂、腊质成分;最后用300 mL甲醇洗脱潜香物质[9],甲醇洗脱液过0.22μm滤膜,待质谱中性丢失扫描分析用。

1.2.2 UPLC-MS/MS分析样品 准确称取1 g烟样(过80目筛)于锥形瓶中,加入50 mL甲醇超声萃取1 h,静置,取上清液1 mL过0.22 μm有机系滤膜,进行UPLC-MS/MS分析。

1.3 色谱质谱条件

AcquityTMBEH C18色谱柱 (2.1 m × 100 mm×1.7μm);柱温40℃,样品室温度4℃;进样体积2μL;流动相A为甲醇,B为0.1%乙酸-乙酸铵(10 mmol·L-1)水溶液;流速0.4 mL·min-1;洗脱条件为:0～2 min,由10%A线性变化为100%A,并保持4 min,6～7 min,由100%A台阶梯度变化为10%A。

电喷雾负离子模式;电喷雾电压-4 500 V;离子源温度500℃;离子源辅助气1,2:4.14× 105Pa。

2 结果与讨论

2.1 潜香物质的鉴定

根据文献报道[10],以吡喃葡萄糖结合的糖苷、咖啡酸等物质在ESI-MS/MS分析中易产生中性丢失162 u的峰,通过实验发现,鼠李糖苷除据文献报道的丢失碎片峰146 u外,也有丢失162 u的现象,这可能是鼠李糖基和连接苷键的O一起丢失而产生的162 u丢失;香豆酸衍生物也有中性丢失162 u,这可能为丢掉香豆酸。本实验利用质谱的中性丢失扫描功能,在优化的碰撞能条件下,对经过前处理的烟草样品进行中性丢失162 u的扫描,得到7种潜香型物质,质谱图示于图 1。带负电荷的母离子分别为:m/z 271.1、325.3、337.1、353.3、355.4、369.0。对分子离子做MS2碎裂分析,全扫描质谱图示于图2。对于有杂质干扰的目标物,采用多反应监测模式同时检测所有子离子,根据液相梯度洗脱下各离子的保留时间确定目标物碎裂峰和杂质碎片峰,其液相色谱图示于图3。

图1 烟样中性丢失扫描质谱图Fig.1 Neutral loss scan mass spectrum of tobacco sample

图2 烟叶中7种潜香物质的MS2碎片离子全扫描质谱图Fig.2 MS2product ion spectra of 7 aroma precursors in tobacco

分子离子 m/z271.3含有碎片离子 m/z 163.4和133.2,分析为葡萄糖基,苷元离子峰[M—162]-为m/z108.9,结合文献[11]判断为熊果苷,其碎裂为分子离子的糖基丢失—CH2OH,产生碎片离子m/z241.8,熊果苷糖基葡萄糖环断裂—CO,产生碎片峰m/z213.0。

分子离子 m/z325.3含有碎片离子 m/z 163.1和133.3,分析为葡萄糖基,苷元离子峰[M—162]-为m/z163.1,结合文献[11]判断为香豆酸-葡萄糖苷。推测其碎裂规律为:分子离子的糖基丢失—CH2OH,产生碎片离子 m/z 294.9,香豆酸-葡萄糖苷糖基葡萄糖环断裂—C2H2O,产生碎片离子 m/z252.8,m/z 118.9是香豆酸丢失—COOH产生的。

图3 多反应监测m/z353.3子离子液相色谱图Fig.3 Liquid chromatogram ofm/z353.3 with multiple reaction monitoring

分子离子m/z337.1产生碎片 m/z162.8,但无糖基进一步的裂解碎片 m/z133.1,也无糖基丢失—CH2OH产生碎片峰,排除是糖苷可能,分析 m/z118.9为162.8 u丢失—COOH,判断为香豆酸,结合特征峰m/z191.1判断为香豆素奎尼酸,其碎裂为分子离子先失 H2O产生碎片离子峰m/z321.3,再丢失—COOH产生碎片峰 m/z279.3,香豆酸在丢失—COOH产生m/z118.9碎片后,再丢失末端—C2H2产生碎片离子m/z93.0。

分子离子 m/z353.3的碎片离子主要有m/z134.8,163.1,173.2,176.9,179.0,191.0。通过MRM模式下的液相梯度洗脱,发现离子对353.3>134.8,353.3>173.2,353.3>179.0, 353.3>173.2,与文献报道的新绿原酸和绿原酸的子离子相同[12],保留时间分别为1.33、1.54 min,碎片峰m/z163.1和176.9,其保留时间均为3.37 min,可判断为杂质碎片。推测其碎裂规律为:母离子断裂C—O键形成咖啡酸碎片离子m/z178.8和奎尼酸碎片离子 m/z190.9 ([M—178.8]-),咖啡酸进一步丢失—COOH产生碎片离子m/z134.8,[M—178.8]-脱水形成碎片离子峰m/z173.2。

分子离子 m/z355.1的碎片离子有 m/z 192.7和134.8,分析为阿魏酸,m/z163.1为阿魏酸丢失 CH3O,m/z134.8为进一步丢失—COOH产生。根据碎片m/z179.2和163.1,判断含有糖基,结合文献[13]分析为葡萄糖基阿魏酸。

分子离子 m/z369的碎片离子有 m/z 192.9、179.2、163.2、132.9,分析含葡萄糖基,糖基碎片离子峰m/z179丢失与苷键连接的O产生碎片 m/z163.2,丢失CH2O产生碎片离子m/z132.9。此外,有 m/z160.9碎片峰分析为糖基丢失—C3H6O2苷元从双键处断裂丢失—C10H14O产生的。结合文献[8]分析为3-氧化紫罗兰醇葡萄糖苷。

综上,对烟叶中7种潜香物质进行了鉴定,其分析结果列于表1。

2.2 潜香物质的质谱碎裂规律研究

根据上述裂解碎片离子的结构分析,确定了不同潜香型物质特征碎片峰,并总结其在 ESIMS/MS模式下的碎裂规律,示于图4。糖苷物质易断裂糖苷键和—CH2OH,形成 m/z163, 133等特征离子峰;香豆酸和咖啡酸易丢失—COOH分别形成 m/z118.9,134.8等特征离子峰;阿魏酸易丢失—CH3O和—COOH形成m/z163.1,134.7等特征离子峰。

表1 烟叶中7种潜香物质的液相色谱-质谱分析参数及结果Table 1 The parameters and results of 7 aroma precursors by UPLC-MS/MS

图4 潜香型物质碎裂规律Fig.4 The fragmentation of aroma precursors

3 结 论

建立了超高效液相色谱-质谱法分析烟叶中7种主要潜香型物质的方法。使用中性丢失扫描并结合MS2特征离子峰分析,能快速的确定潜香型物质母离子及其碎片离子。

在没有标准品的情况下,由于样品中与目标物母离子质量数相同的杂质很多,采用样品做MS2扫描会产生很多杂质碎片峰,通过对各碎片离子的多反应监测保留时间的对比,可以有效的排除杂质离子,便于碎裂规律分析,适合复杂体系未知物结构的研究。

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Rapid Analysis of 7 Aroma Precursors in Tobacco by UPLC-ESI-MS/MS

WU Xin-hua1,2,ZHU Rui-zhi1,3,WANG Kai1,3, REN Zhuo-ying1,MOU Ding-rong1,WEI Wan-zhi3,MIAO Ming-ming4
(1.R&D Center ofHongta Tobacco(Group)Co Ltd,Yuxi653100,China; 2.Kunming University of Science and Technology,Kunming650224,China; 3.School of Chemistry and Chemical Engineering,Hunan University,Changsha410082,China; 4.Yunnan Academy ofTobacco Science,Kunming650106,China)

A method for identification of 7 aroma precursors in tobacco was established by using ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry interfaced with electro-spray ionization(UPLC-ESI-MS/MS)in the multiple reaction monitoring(MRM) mode.Aroma precursors in tobacco were extracted with methanol,cleaned up with XAD-2 column,then detected and identified by ESI-MS/MS with the neutral loss method.According to the characteristic product ions ofm/z192.7,179.2,163.1,134.7,133.2 acquired by product ion scan(MS2),7 potential flavor compounds are identified,they are arbutin, trans-p-coumaric acid-4-o-β-D-glucopyrannoside,coumaroylquinic acid,neochlorogenic acid,chlorogenic acid,feruloylglycoside,3-oxo-α-ionol-β-D-glycoside.The method is rapid, convenient and suitable for the determination of aroma precursors in tobacco leaves.

O 657.63

A

1004-2997(2010)02-0088-06

2009-08-27;

2009-11-24

吴新华(1984～),男(汉族),湖北监利县人,硕士研究生,从事烟草化学研究。E-mail:wuxinhuagg@yahoo.com.cn

朱瑞芝(1978～),女(汉族),湖北公安县人,博士,从事烟草化学研究。E-mail:zhu.ruizhi@163.com