银杏黄酮苷元对氧化低密度脂蛋白所致内皮细胞功能的影响*

何 艳,付永昕,吴立荣,方 颖,李 屏,李安敏

(贵州省贵阳医学院附属医院心内科,贵阳 550005)

氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)导致内皮功能障碍在动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)病理过程中起关键作用[1],植物血凝素样低密度脂蛋白受体-1(lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1,LOX-1)作为近期发现的主要在内皮细胞表达的ox-LDL特异性受体,介导了ox-LDL对内皮细胞的损伤作用[2]。银杏黄酮苷元(ginkgo aglycone,GA)是通过酸水解-重结晶法去除单糖后获得的新型银杏叶提取物(ginkgo biloba extract,GBE),与传统GBE比较,具有较强的脂溶性和体内生物效价高的特点,目前国内外对GBE防治动脉粥样硬化的实验研究和临床应用很多,但对GA的研究却很少。本研究在培养的人脐静脉内皮细胞株ECV304上观察了不同浓度GA、作用不同时间对 ox-LDL所致的内皮细胞表面单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)和LOX-1异常表达的干预,以期为GA进一步用于临床防治AS性疾病提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 人脐静脉内皮细胞株ECV304(中国典型培养物保藏中心提供)。ox-LDL(中山大学谢志忠博士提供)。DMEM培养基(Gibco)、聚肌苷酸(Polynosinic acid,PIA,Sigma公司生产)。新生小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所提供)。总RNA提取 Trizol试剂及逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerse chain reaction,RT-PCR)试剂盒(北京天根生化科技有限公司生产)。MCP-1酶联免疫吸附反应(ELISA)试剂盒(Boshide);LOX-1兔抗人多克隆抗体(Sata Cruz);染色体图像分析仪(Leica);梯度 PCR仪(Eppendorf公司AG22331型);凝胶图像分析系统(Eppendorf公司AG22331型)。上海捷瑞生物工程有限公司合成引物序列如下,MCP-1mRNA(177 bp)上游引物:5′-AGG AAG ATC TCA GTG CAC AGA GG-3′,下游 引物:5′-AGT CTT CGG AGT TTG GGT T TG-3′;LOX-1mRNA(193 bp)上游引物:TTA CTC TCC ATG GTG GTG CC,下游引物:AGC TTC TTC TGC TTG TTG CC;β-actin mRNA(295 bp)上游引物:5′-TCA CCC ACA ATG TGC CCA TCT ACG A-3′,下游 引物:5′-CAG CGG AAC CGC TCA TTG CCA ATG G-3′。 GA由贵州省生化中心何照范教授惠赠(主要成分:槲皮素25.75%、山奈酚15.26%、异鼠李素 1.77%、总黄酮苷元占总成分含量42.79%)。其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 人脐静脉内皮细胞株ECV304培养 将所购的人脐静脉内皮细胞株ECV304用含10%胎牛血清、100 u/mL青霉素和100 u/mL硫酸链霉素的DMEM培养液继续培养,置于37℃、5%CO2培养箱中孵育,当细胞生长至80%融合以上时,用体积分数0.25%胰酶消化后,以1∶2或1∶3传代,传代后第2天换液1次,以后每2～3天换液1次,约 3～4 d可长成单层细胞。实验分组:取对数生长期细胞,随机分为对照组(培养基),ox-LDL组(培养基中加入终浓度为50 mg/L的ox-LDL后继续培养24 h)、银杏黄酮苷元浓度效应组(GA6.25、12.5、25、50 mg/L预先培养48 h,然后加入终浓度为50 mg/L的ox-LDL培养24 h),银杏黄酮苷元时间效应组(GA 25 mg/L预先分别作用6、12、24 h后,加入终浓度为 50 mg/L的ox-LDL培养24 h),LOX-1拮抗剂组(PIA250 mg/L预先作用2 h后,加入终浓度为50 mg/L的 ox-LDL培养24 h)。

1.3 内皮细胞形态学观察 相差显微镜观察各组细胞形态变化。

1.4 M CP-1和LOX-1mRNA测定 样品总RNA提取采用Trizol试剂盒,操作按试剂盒说明进行。A260/A280测定RNA浓度和纯度。采用二步法逆转录试剂盒,将RNA逆转录成cDNA作为模板进行扩增。PCR反应条件均为94℃预变形5 min,94℃变性30～40 s,55.4～60.5℃退火40 s,72℃延伸1 min,循环40次,最后72℃延伸 10 min,反应终产物立即进行电泳跑胶,用凝胶图像分析扫描、电泳结果并照相,测定各条带吸光度值。以恒定表达的β-actin mRNA作为内参进行校正,计算相对表达量。实验重复3次。

1.5 MCP-1蛋白表达测定 采用ELISA法检测。常规消化细胞,将等量细胞悬液分别接种于24孔培养板上,调整细胞浓度为5×105个/孔,待细胞长成单层贴壁后,按上述试验分组,达作用时间之后,取细胞培养上清液离心,再收集上清液置于-20℃保存,然后按试剂盒说明操作。置于酶标仪在450 nm处测定OD值,并记录结果(每组设6个复孔)。

1.6 LOX-1蛋白表达测定 采用SP免疫组化法检测。用特异性兔抗人 LOX-1多克隆抗体进行细胞免疫组化鉴定,以PBS代替一抗作阴性对照,于显微镜下观察并计数,以胞浆和胞膜着色为棕黄或棕褐色颗粒为LOX-1蛋白表达阳性细胞,计数阳性细胞数和染色强度累计积分,结果以均数表示。

1.7 统计学方法 采用SPSS11.5统计学软件进行分析,数据以表示,多组间比较进行方差齐性检验和单因素方差分析(one-way ANOVA),P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞形态观察 与对照组比较,银杏黄酮苷元(≤50 mg/L)对 ECV304生长无影响,细胞贴壁生长,黏附紧密,呈典型的铺路石样分布。

2.2 银杏黄酮苷元对 ox-LDL诱导的脐静脉内皮细胞株ECV304 MCP-1和LOX-1mRNA表达的影响 通过RT-PCR方法检测各组内皮细胞上M CP-1和LOX-1mRNA水平的表达,结果(图1～3)显示:与对照组比较,ox-LDL可明显上调MCP-1和LOX-1的mRNA表达,差异有统计学意义(P＜0.05)。用GA预处理48 h后,在6.25～50 mg/L浓度范围内,均可显著抑制 ox-LDL诱导内皮细胞MCP-1和 LOX-1 mRNA表达;且此效应25 mg/L组大于12.5 mg/L组及6.25 mg/L组,差异有统计学意义(P＜0.05),提示此效应有一定浓度依赖性。

以25 mg/L GA预处理细胞6～24 h,均可显著抑制ox-LDL诱导细胞MCP-1、LOX-1mRNA表达,差异有统计学意义(P＜0.05)。药物效应24 h组大于12 h和6 h组,差异有统计学意义(P＜0.05),而 12 h和6 h组之间差异无统计学意义(P＞0.05),提示GA与细胞作用6 h后即可发挥抑制MCP-1和LOX-1mRNA表达的作用,该作用在 24 h时较强。用LOX-1阻断剂 PIA对细胞进行预处理2 h,可显著抑制ox-LDL诱导的内皮细胞MCP-1和LOX-1mRNA表达。

图1 各组MCP-1和LOX-1基因的RT-PCR结果

图2 GA对ox-LDL诱导内皮细胞MCP-1表达的影响

图3 GA对ox-LDL诱导内皮细胞LOX-1基因表达的影响

2.3 银杏黄酮苷元对ox-LDL诱导的内皮细胞MCP-1蛋白表达的影响 ELISA法检测各组细胞MCP-1蛋白表达量,结果(图4)显示,ox-LDL作用后,细胞上清液MCP-1的表达量显著升高,差异有统计学意义(P＜0.01)。用GA预处理48 h后,在6.25～50 mg/L终浓度范围内,可显著抑制ox-LDL引起的内皮细胞MCP-1的分泌,效应有一定的浓度依赖关系,差异有统计学意义(P＜0.05);用终浓度25 mg/L的 GA预处理6～24 h,可显著抑制ox-LDL引起的MCP-1分泌,呈时间依赖关系,差异有统计学意义(P＜0.01)。

2.4 银杏黄酮苷元对ox-LDL诱导的内皮细胞LOX-1蛋白表达的影响 通过SP免疫组化法检测各组细胞LOX-1蛋白表达量,结果(封2图5、表1)表明:经 ox-LDL作用后,内皮细胞LOX-1蛋白被大量地诱导表达,与对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.05)。分别用终浓度25 mg/LGA预处理48 h和250 mg/L LOX-1受体阻断剂PIA预处理2 h,均可完全阻断ox-LDL诱导内皮细胞 LOX-1蛋白过量表达与ox-LDL组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);与对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。

图4 GA对内皮细胞oxLDL诱导内皮细胞MCP-1蛋白表达的影响

表1 GA对ox-LDL诱导内皮细胞LOX-1蛋白表达的影响

表1 GA对ox-LDL诱导内皮细胞LOX-1蛋白表达的影响

*:与对照组比较,P＜0.01;#:与ox-LDL组比较,P＜0.01。

组别 LOX-1蛋白含量对照组(0 mg/L) 7.6±0.8944 ox-LDL 14.6±1.6733*PIA 7.6±1.5166b#G A(25 mg/L) 8.2±0.8367b#

3 讨 论

MCP-1作为一种强有力的趋化因子,促进循环中的单核细胞聚集于血管内皮间隙,并促进单核细胞清道夫受体表达,进而摄取脂质,转变为泡沫细胞,成为AS发生的早期事件。ox-LDL是目前公认的致AS的重要危险因子,导致血管内皮细胞功能紊乱,合成和分泌大量黏附分子和趋化因子[3]。研究认为内皮细胞通过其表面受体LOX-1吞噬和降解ox-LDL是其功能发生障碍的主要原因。

近年来GBE在AS防治方面的基础研究取得了一定的进展。研究发现GBE增加循环内皮祖细胞端粒酶活性,抑制过氧化氢所致内皮细胞凋亡蛋白3活性,促进内皮祖细胞增殖,从而促进内皮细胞增殖和修复[4-5];干预内皮细胞损伤后一氧化氮合酶的表达,改善内皮功能[6-7];对AS大鼠致炎细胞因子白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)表达显著抑制,对抗炎细胞因子白细胞介素-10及其受体表达显著上调[8]。

本研究发现,GA可显著抑制ox-LDL诱导的内皮细胞MCP-1表达,且该效应在6.25～25 mg/L范围内,具有一定的浓度和时间效应关系。提示GA可能通过影响内皮细胞MCP-1表达,减少或预防ox-LDL所致的内皮细胞黏附功能紊乱。而GA和LOX-1受体阻断剂PIA干预LOX-1表达的同时,阻断了MCP-1的异常合成和分泌,提示LOX-1可能作为一种信号分子参与ox-LDL诱导的内皮细胞MCP-1表达的调节过程。LOX-1的表达受多种因素包括ox-LDL、TNF、高同型半胱氨酸等调节,这些物质均与体内氧化应激相关。核因子-κ B(nuclear factor-κ B,NF-κ B)和激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)是调节真核生物氧化还原反应的重要转录蛋白,在AS氧化应激病理过程中发挥重要作用。研究表明,LOX-1基因启动子上存在NF-κ B和AP-1结合位点,而本研究中 GA黄酮含量高达42.79%,黄酮类物质是天然抗氧化物家族中的重要成员之一,能有效清除超氧阴离子、羟自由基、一氧化氮等。Chen等[9]研究显示,GBE可以下调内皮细胞中活性氧族生成,抑制 NF-κ B、AP-1表达。提示GA可能通过干预氧化应激造成的内皮细胞LOX-1上调而抑制MCP-1表达。

因此,银杏黄酮苷元作为一种新型银杏叶提取物,能够显著下调ox-LDL诱导的内皮细胞LOX-1表达,从而抑制MCP-1的异常合成和分泌,改善内皮细胞黏附功能,发挥抗动脉粥样硬化作用。

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