小鹅瘟病毒蛋白质的研究概况

葛 凯 王桂军 李培英 夏伦斌 陈习中 左瑞华

（①皖西学院生物与制药工程学院 安徽六安 237012 ②安徽农业大学动物科技学院 合肥）

小鹅瘟病毒蛋白质的研究概况

葛 凯①王桂军②李培英②夏伦斌①陈习中①左瑞华①

（①皖西学院生物与制药工程学院 安徽六安 237012 ②安徽农业大学动物科技学院 合肥）

小鹅瘟是雏鹅的一种急性或亚急性败血性传染病，其病原体是小鹅瘟病毒(Gosling Plague virus，GPV)，即鹅细小病毒(Goose Parvovirus，GPV)。该病是我国学者方定一于1956年首次在江苏扬州发现，60年代后，在欧洲、亚洲等国家相继报道该病的发生与流行。1974年，国际禽病学会(WPSA)正式将该病命名为Derzsys氏病。该病主要侵害出壳后4～20日龄的鹅雏，也感染鸭雏，传播速度快，发病率和死亡率较高。临床以腹泻、呼吸困难、脚软、渗出性肠炎为主要症状。细小病毒感染已成为水禽养殖业中危害比较严重的病原，给水禽养殖业造成巨大的损失[1]。为更深入的认识GPV的生物学特性，有效防制小鹅瘟，近年来很多学者对其病毒蛋白质进行了大量的研究。

1 GPV的生物学特性

GPV属细小病毒科细小病毒属，病毒外观呈圆形或六角形，无囊膜，20面体对称，直径约20～25nm，空心内直径为15nm，外壳厚5nm，对角直径为25nm[2]。具有感染性的病毒粒子为110S，缺少DNA的病毒粒子为65S。GPV对外界因素具有很强的抵抗力，56℃加热1h仍能使鹅胚死亡。病毒对乙醚、氯仿、胰酶有抵抗力，对紫外线敏感。

GPV属于自主性细小病毒。无需辅助病毒可自主复制。其基因组是在被感染细胞的染色体复制开始以后在细胞核内合成。因此，必须在细胞培养同时接种病毒，这样才能达到使病毒增殖的目的。GPV 的复制主要在细胞核内进行，并形成大型包涵体，在细胞培养物中隐藏期约10～16h，接种后10～24h，在病毒DNA合成的同时，形成细胞核内抗原并出现病毒粒子。

2 GPV的蛋白质

2.1 非结构蛋白 GPV的非结构蛋白Rep1和Rep2位于基因组左侧阅读框(LORF)，在GPV的537bp的第1个ATG起始Rep1，在1065bp的第2个ATG起始Rep2，两者共同终止于2418bp的UAA密码子。其基因长度分别为1884和1356bp，编码的Rep1和Rep2相对分子量大小分别约为68.7和49kDa，Rep1和Rep2蛋白多肽分别由627个和451个氨基酸组成。Rep蛋白在病毒复制早期产生，其功能主要是参与病毒DNA的复制和基因表达的调节[3]。Rep1为磷酸化蛋白，同参与调节启动子的细胞因子结合，在细小病毒DNA早期复制过程有多种功能：①可与病毒DNA复制起始序列高亲力结合，对病毒DNA的复制是必须的；②抑制细胞DNA的复制；③对衣壳蛋白的启动子起正调节作用；④对P41启动子起负调节作用。非结构蛋白Rep1不仅在病毒的生活周期中起着十分重要的调控作用，而且具有抑制多种肿瘤发生的能力。这一现象的可能原因是：肿瘤组织为细小病毒的繁殖提供了适宜环境，而Rep1蛋白的形成可干扰细胞中一个14 kDa的蛋白质的磷酸化作用，进而抑制细胞DNA的合成并表现出毒性作用，从而使细小病毒表现出溶瘤作用[4]。

GPV Rep1蛋白能共价结合于复制型DNA 5’末端，具有特异部位的解旋活性，并且其具有保守序列GPTTGKE[3]。目前认为该类保守序列是ATP结合部位，具有DNA解旋活性，拓展了GPV DNA末端空间构型，并起始病毒DNA的复制，GPV Rep2蛋白氨基酸序列按肽链C端到N端方向同Rep1蛋白完全重叠。GPV Rep2蛋白同Rep1蛋白对细胞的毒性有协同作用，但Rep2蛋白对细胞毒性作用很小，它能促进Rep1蛋白对细胞的毒性作用。此外Rep2蛋白还可能与病毒DNA和蛋白质有效合成以及病毒增殖有关[5]。

2.2 结构蛋白 GPV的结构蛋白研究的比较深入，它是病毒的衣壳蛋白，参与病毒的免疫。GPV共有3种结构蛋白，分别为VP1，VP2和VP3，位于基因组右侧开放阅读框架(RORF)。编码VP1，VP2和VP3蛋白的起始密码子分别位于2439，2874和3033bp，共同终止于4635bp。但Zadori等[6]对GPV全基因序列分析时发现，右侧阅读框中仅有2个ATG 密码子，从ATG所在核苷酸的位置来看，它们分别为VP1和VP3蛋白的起始密码子。通过与腺联病毒-2(AAV2)序列比较及从SDS-PAGE表现的蛋白带大小推测，GPV VP2蛋白的起始密码子为不典型的ACG。编码VP1，VP2和VP3蛋白的基因长度分别为2199，1764和1605 bp；通过ORF推测VP1，VP2和VP3蛋白的大小分别是81.3，65.0和57kDa，但SDS-PAGE估计的3种蛋白质大小却分别是87，73和60kDa；VP1，VP2和VP3蛋白多肽分别由732，587和534个氨基酸组成。GPV的VP1和VP2是从P41启动子(位于VP1起始密码子之前的潜在启动子，为TTTTAA)转录的mRNA的选择性拼接位点翻译而来，VP1包含整个VP2的序列，VP2从mRNA的2455nt处的剪接受体位点剪接加工后翻译出VP2和VP3，而VP3是在整个核衣壳形成之后从VP2氨基端剪去部分氨基酸形成的。因此VP1蛋白多肽氨基酸序列与VP2按肽链C端到N端方向完全重叠，VP3蛋白多肽氨基酸序列与VP2和VP1按肽链C端到N端方向完全重叠。张云等[7]研究表明，GPV的结构蛋白处于219～221，582～584，700～702，712～714位氨基酸，都是潜在的糖基化位点。

衣壳蛋白VP1，VP2和VP3是决定GPV病毒嗜性、宿主域和致病性的关键因素。其中VP1可协助病毒或其DNA通过核孔转运至细胞核内，可与宿主细胞的特殊受体结合，使病毒粒子进行有效感染[8]。Tullis等[9]证实VP1蛋白是小鼠细小病毒复制和病毒粒子包装必需的一种结构蛋白，缺失VP1的病毒突变体的克隆，转染敏感细胞后，尽管仍可起始DNA复制并产生子代病毒，但已丧失对细胞的感染性，即不能产生感染性病毒粒子。VP1与细胞的结合是一种特异性受体结合，因此推测GPV VP1蛋白在病毒侵袭细胞并产生感染性方面是一个重要的结构区域。如果编码VP1蛋白的基因缺失，可能会影响GPV复制和病毒粒子包装，形成缺损子代病毒，丧失对细胞感染的能力。另外VP1 N端富含碱性残基，存在类似SV40和多瘤病毒VP1蛋白N端的核内定位信号序列，这种序列信号特征对于其在细胞核内定位至关重要。在GPV VP1多肽第56位氨基酸处有相对保守的结构域“PGY”，无感染性缺损病毒的基因组中没有这种保守结构域，因此推测“PGY”保守结构域可能是产生完整病毒结构蛋白和成熟病毒粒子必不可少的功能结构区域。

VP2是主要免疫功能区，可刺激机体产生中和抗体，在没有VP1存在条件下VP2可自我组成病毒样颗粒。Strassherme等[10]研究犬细小病毒衣壳蛋白时发现，2个决定中和抗体产生位点区，一个位于纤突顶端，另一个位于VP2第300氨基酸残基周围及三倍体纤突的“肩部”，碱基突变可引起病毒抗原性的变化。犬细小病毒衣壳蛋白中有10个抗原表位，免疫吸附试验表明，其中6个抗原位于病毒表面，3个位于VP2氨基端，3个位于病毒三重对称轴上形成“穗状突起”的VP2的“环”上，说明VP2是刺激机体产生中和抗体的主要部位。推测GPV VP2蛋白可能参与GPV DNA的包装，与VP1一起协同作用，形成具有感染性的病毒粒子。

GPV VP3蛋白是病毒的主要衣壳蛋白，约占衣壳蛋白总含量的80%。Zadori等[6]通过GPV衣壳蛋白三维结构模拟比较分析发现，暴露于病毒粒子表面的氨基酸序列均出现在VP3蛋白多肽链内，表明VP3内含有GPV主要抗原决定簇成分，是GPV主要免疫保护性抗原，能诱导机体产生具有中和作用的抗体。李新华(1998年)用淋巴细胞杂交瘤技术研制出7株抗GPV单克隆抗体，均同时与GPV的VP2和VP3多肽链发生反应，表明VP2和VP3都为GPV的免疫保护性抗原，能够刺激机体产生具有中和作用的抗体，2种结构蛋白多肽之间可能含有一些相同的抗原决定簇成分。卢菲等[11]研制VP3基因疫苗，免疫小鼠后能诱导产生细胞免疫和体液免疫应答，并且基因疫苗的免疫效果比弱毒疫苗要强。余兵等[12]用地高辛标记VP3基因的部分序列作为核酸探针，分析发现该序列具有很高的保守性。

3 GPV蛋白质的体外表达

目前报道的鹅细小病毒蛋白已在大肠杆菌、痘病毒、杆状病毒等载体中进行了表达，且主要集中在结构蛋白，非结构蛋白报道较少。贺云霞等[13]将GPV VP2基因亚克隆在原核表达载体pPROEX-HTb上，IPTG诱导后成功表达出与预期大小相符的约72 kDa的融合蛋白，光密度扫描对表达产物进行初步定量，表明表达产物约占菌体总蛋白的14%。表达产物经Ni-NTA金属鏊合层析柱纯化后，得到了纯度较高的6His-VP2融合蛋白，采用Western-blot方法检测结果表明所得的6His-VP2融合蛋白具有较好的反应原性。马君等[14]将GPV主要结构蛋白VP2和VP3基因插入到原核表达载体pET-28b中，为高效原核表达打下基础。李雪梅等[15]则将GPV的VP2-VP3基因插人到原核表达质粒PET-28a的多克隆位点上，构建了原核表达载体pEGVP1，将它转化到宿主表达菌BL21中，经IPTG诱导，SDS-PAGE电泳可见表达产物的分子量均约为75kDa，Western- blot检测表达产物与相应抗体具有一定的反应原性。同时还将其克隆到核酸疫苗质粒pIRES1-neo载体上，构建了核酸疫苗重组质粒pIGVP1，再将重组质粒转染到鹅胚成纤维细胞上，经Western-blot检测其表达产物可出现特异性反应带，证明表达产物具有很好的反应原性。田丽红等[16]将GPV H1株的VP3基因亚克隆于pSY538的EcoR1位点，然后将带有痘苗病毒启动子P11的LacZ报告基因平端克隆于上述重组子的SmaI位点，再用NotI切下同时含有VP3基因和LacZ报告基因的片段，再亚克隆于pSY681的NotI位点，构建出含有VP3基因的重组禽痘病毒转移载体，为构建表达VP3基因的重组禽痘病毒打下了基础。 Takeara等[17]将GPV VP1基因克隆到杆状病毒载体，构建了重组杆状病毒。该重组病毒表达了与VP1蛋白分子量相符的88 kDa的蛋白，并用免疫印迹法得以检测。通过间接荧光抗体试验(IFA)在昆虫的细胞核中发现大颗粒的表达蛋白，电镜观察在重组病毒感染的核内也发现有几个大粒子。虽然表达蛋白聚集成颗粒的原因尚不清楚，但这似乎为重组GPV VP1衣壳蛋白所特有，使用这些颗粒作为IFA抗原，血清滴度与细胞核内获得的特异性荧光颗粒的最高血清稀释度成负相关。以上这些都为开发研制GPV新型分子诊断试剂和抗GPV感染的基因工程疫苗提供了理论和实践依据。

对非结构蛋白的研究，邢明伟等[18]扩增出了GPV H1株NS2基因，与国外已发表的GPV B株相比核苷酸序列同源性为98.75%，推导氨基酸序列同源性为98.67%。最近，邢明伟等[19]又将NS2基因亚克隆于原核表达栽体pGEX-6P-1中，获得重组质粒pGEX-NS2。经过亲和层析方法获得了纯化的重组NS2蛋白，检测结果表明，表达的重组NS2蛋白可以与GPV阳性血清发生特异性反应。王锐等[20]从分泌抗GPV-NS1单克隆抗体的杂交瘤细胞中克隆得到抗体的重链和轻链可变区基因，构建了抗GPV-NS1蛋白单链抗体基因，并将其在大肠杆菌中表达，获得了具有生物活性的单链抗体蛋白。

由于GPV 具有许多特性，可以将GPV的VP3基因在乳酸杆菌中进行表达，以研制出口服的GPV基因工程疫苗，主要原因在于：①目前所用的GPV灭活苗和弱毒苗口服在临床上显示出较好的免疫效果，说明GPV疫苗可产生较好的黏膜免疫反应，且肠道具有丰富的淋巴器官和免疫细胞，其淋巴细胞约占机体总淋巴细胞的80%左右，因此肠道免疫具有较大的潜力。② GPV VP3基因是病毒的主要免疫原性蛋白，其氨基酸序列的高度保守性正是目前GPV仅有一个血清型的原因所在，且不同来源的毒株变异性较小。刘中勇等[21]分析了7株GPV的不同地方株，发现其同源性均在93%以上，应用CLUSTAL W软件分析其相同区域核苷酸序列发现其趋异率均小于6%。陈晓月等[22]研究表明，GPV辽宁株基因组中的VP3基因同国外的GPV B株核苷酸序列同源性为98.5%，氨基酸序列同源性为98.3 %。③肠道是GPV首要的感染途径，且肠道病变最严重，说明GPV对肠细胞有很好的嗜性，因此口服免疫可在更早的时间消灭病毒，达到预防的目的。④乳酸杆菌是一种非致病的益生菌，本身就具有抗菌、抗病毒的作用，将两者联合应用，可同时发挥两者的综合效应。这些都为研制GPV乳酸杆菌基因工程苗提供了理论上的可行性。

4 展望

尽管 GPV基因组早在1995年就已经测出，但对GPV蛋白质的认识还远远不够，特别是对Rep蛋白的作用机制和功能以及GPV蛋白复制、转录与翻译的特殊性等方面均有待进一步研究。如何提高重组的致弱病毒和细菌对VP蛋白的表达量及在益生菌中有效表达GPV-VP蛋白，以开发出口服GPV基因工程疫苗，这些都是小鹅瘟以后的研究课题。

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S858.33

C

1007-1733(2010)12-0080-04

安徽省高校省级自然科学研究项目(KJ2010B263)

2010–10–19）

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