林木悬浮细胞系建立过程中的影响因素

崔国栋

(吕梁山国有林管理局车鸣峪林场,山西 中阳 033400)

1 植物细胞悬浮培养

植物细胞悬浮培养(Cell suspension culture)是指将植物细胞或小的细胞团悬浮于液体培养基中,并使细胞保持在良好分散状态下进行培养的技术,即植物细胞生长的微生物化[1]。细胞悬浮培养不仅可直接用于原生质体分离、培养与杂交,基因转移和生产次生代谢物等,还可短期内在细胞水平筛选出预期突变体。因此,细胞悬浮培养已成为植物生物技术中最有用的手段之一[1,2]。

2 林木悬浮系建立过程中的影响因素

2.1 培养材料

2.1.1 外植体和基因型

外植体(胚性愈伤组织)来源和状态对细胞悬浮系的质量及单细胞的再生能力均有一定影响。建立软枣猕猴桃(Actinidia arguta)悬浮细胞系时,发现随着生长期的增加,褐化发生的时间越短,褐化越严重,并且活细胞率也越低,畸形细胞增多[3]。植物悬浮细胞系的建立对基因型的依赖是普遍存在的难题,有研究表明,在龙眼 (Dimocarpus longan)悬浮植株再生的研究中,3种龙眼的各悬浮参数不同[4]。

2.1.2 愈伤组织类型

悬浮细胞系的建立通常是以生长快、易散碎的松散胚性愈伤组织为起始材料,对于培养难度较大的木本植物来说,建立悬浮细胞系成功的关键在于松散、易碎的胚性愈伤组织的诱导和胚性保持[5,6]。胚性愈伤组织的类型一般可分为两种:1)质地坚硬、块状、颜色浅黄且表面有光泽的胚性愈伤组织。2)质地疏松、易分散、不分泌黏液、颗粒状且表面有光泽的胚性愈伤组织。其中第 2类胚性愈伤组织适合悬浮培养,建立的悬浮细胞系生长旺盛,细胞内含物充实。因此,每次继代培养时,应挑选第 2类愈伤组织作为培养材料[7,8]。

2.1.3 培养材料的褐化

褐化在植物悬浮细胞培养过程中普遍存在,其能否得到有效的控制是植物悬浮细胞培养能否成功的关键所在[9,10]。导致褐化的因素较多,如基因型、附加物、基本培养基和培养条件等。不同的激素对愈伤组织和细胞的作用是不一样的,因此,对愈伤组织和细胞褐化的影响也不同。常用于胚性愈伤组织诱导和保持及增殖培养的抑制褐化附加剂有:硫代硫酸钠 (Na2S2O3)、柠檬酸 (CA)、半胱氨酸 (Cys)、维生素 C(Vc)、脱落酸(ABA)、二硫苏糖醇 (DTT)、聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)、活性碳 (AC)、硝酸银(AgNO3)、植酸 (PA)、水解酪蛋白 (CH)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)等,不同的抗褐化剂对愈伤组织和细胞褐化的抑制作用是不同的[11]。在红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)悬浮细胞培养中,1 000 mg/L活性碳,600 mg/L水解酪蛋白,100 mg/L植酸能完全控制褐化,而硫代硫酸钠、柠檬酸、半胱氨酸、维生素 C、脱落酸不能有效地控制其褐化[12]。

2.2 培养基成分

2.2.1 基本培养基

培养基中大量元素的浓度对悬浮培养愈伤组织细胞存活率有较大影响。研究表明,当培养基中大量元素总浓度过高时,枸杞(Lycium bararum)悬浮系中活细胞百分率降低,还可看到许多细胞呈皱缩状态,这说明培养液渗透压过高[13]。在建立印楝(Azadirachta indica)悬浮细胞系过程中也发现,B5较 M S对悬浮系的建立更为有效,接种在 MS培养基上的愈伤组织悬浮起来较困难,并且生长缓慢,在继代过程中容易出现褐化现象;而接种到 B5培养基上的愈伤组织,很容易悬浮起来,继代 3次即可建立比较均匀的悬浮培养系,生长迅速,并且在继代培养过程中没有出现褐化现象[14]。

2.2.2 植物激素

在细胞悬浮培养时,需要添加适当比例的植物激素,才能保持胚性细胞的分裂,但是激素的绝对量也是很重要的,不同的植物种类需要的激素种类也是不一样的。雷公藤(Tripterygium wilfordii)愈伤组织在含 2,4-D的培养液中细胞生长最慢,干物质产量最低;在含 IAA的培养液中,细胞生长速度和干物质产量中等;在含 NAA的培养液中生长最快,每升培养基上收获的干物质产量最大[15]。高桂珍等在研究不同化学因子对喜树(Camptotheca acuminata)细胞悬浮培养生长效应时发现,单因子以NAA效果最好,其中NAA最佳浓度为 0.5 mg/L;组合因子比单因子更有利于细胞的生长,以0.5 mg/L NAA+0.1 mg/L KT的效果最佳[16]。

2.2.3 有机附加物

木本植物组织和细胞培养以无机氮为主,有时辅以有机氮源,氨基酸是常用的有机氮源之一[17,18],加入氨基酸一方面可以为植物细胞提供氮源,另一方面可为细胞代谢提供中间产物。许多天然有机物或其制成品也可加入植物培养基中,而且比加入某种单一的氨基酸更好。水解酪蛋白能显著提高南方红豆衫[19](Taxus chinensis var.mairei)和葡萄[20](Vitis vinifera)悬浮细胞的生长速率和细胞培养密度。肌醇能促进龙眼胚性悬浮细胞分化,延缓悬浮细胞衰老[4]。不同浓度的肌醇对半夏(Pinellia ternata)悬浮细胞生长影响不大,但浓度过高可抑制细胞的增殖[21]。糖类物质是植物组织和细胞培养中最常用的碳源和能源,同时又是维持细胞生长所需渗透压的渗透压稳定剂[22]。研究发现,培养基中的蔗糖浓度由 2%增加到 3%时,黄连悬浮细胞生长有明显加快,但蔗糖浓度在 3%～6%范围内,收获物的干重、细胞生长速率未有明显变化;当蔗糖浓度为 7%时,生长速率开始下降,说明 3% 的蔗糖浓度适合黄连细胞生长,这与细胞生长受到抑制和部分细胞褐变死亡有关[23]。

2.3 培养条件和培养方式

2.3.1 培养起始密度

木本植物细胞悬浮培养时,起始密度对悬浮细胞生长影响较大。如白木千(Picea meyeri)细胞胚悬浮培养时,接种量为 3.0%,细胞增殖的延迟期缩短,很快进入对数生长期,胚性愈伤组织生长率为182%,培养 9 d后达到最大值 8.46 g/100 mL[24]。因此,植物细胞悬浮培养时必须达到最低有效密度。当接种密度过大时,一方面需要大量材料,另一方面培养液中的养分很快被消耗殆尽。只有起始接种量与营养物比例适合,才能达到最好的培养效果,既可充分利用营养物,又可提高悬浮细胞的有丝分裂指数。

2.3.2 新旧培养液比例与转速

悬浮培养细胞能分泌某些促进细胞分裂的物质,因而旧培养液中含有这些物质。向新鲜培养基中加入旧悬浮细胞培养液,可促进继代细胞分裂[25]。换液时,保留培养液比例是很重要的,旧培养基太少(小于总培养基的 1/10),细胞不能生长,并且容易褐化死亡;旧培养基比例大时,细胞又容易变得不致密,易呈饥饿态[23,25]。

由于植物细胞比细菌或真菌细胞大 10倍～100倍,在细胞悬浮培养过程中,摇床转速过高易产生对细胞伤害的剪切力;转速过低,不但细胞易成团,且易堆积,造成营养死角,使细胞得不到充足的营养,最后衰老死亡,且转速低使瓶内溶氧量减少,不利于细胞生长[26]。植物细胞对剪切力的敏感性要高于微生物,一般转速应控制在 90 r/min～120 r/min。

3 结语

影响木本植物悬浮培养的因素主要有以上 3个方面,具体到某一种木本植物进行悬浮培养时要根据培养材料的具体表现调整培养条件,最终目标是操作简便、悬浮系优良。建立完善的树木细胞悬浮培养体系,不仅是生产树木有用次生代谢产物、发展树木经济价值的有效途径,而且是实现树木远缘杂交的基础性体系。随着各项科学领域的进一步发展,我们将会发现植物细胞悬浮培养体系在林业发展中具有更重要的作用。

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