RNA干扰技术在养殖业中的应用

赵亚娟 潘树峰 郭 微

（辽宁省农业技术学校 沈阳 110000）

RNA干扰技术在养殖业中的应用

赵亚娟 潘树峰 郭 微

（辽宁省农业技术学校 沈阳 110000）

RNA干扰是生物进化过程中遗留下来的一种在转录后通过RNA调控基因表达的机制，它是指在真核细胞中引入双链RNA分子从而导致具有序列同源性的基因产生特异性基因沉默(gene silencing)的现象[1]。2001年和2002年RNAi研究连续两年入选美国《科学》杂志评定的年度自然科学十大突破。目前，RNA干扰技术已成为基因功能研究的有力工具，并在人类疾病模型、基因治疗、新药研发以及畜牧遗传育种等诸多领域展示了诱人的应用前景。该技术首先在线虫和果蝇等低等生物中取得突破，随之发展成为基因功能研究的有力工具。由于RNAi机制具有超越疫苗和抗病毒药物的诸多优点，它也给许多疾病的防治提供了新的思路。

1 RNA i的分子机制

目前关于基因沉默的假说认为,转录后水平的基因沉默包括3个阶段:起始、维持、信号放大与传播[2]。

1.1 起始阶段 包括dsRNA形成、识别和小干扰RNA( siRNA)片段的产生。由RNA病毒复制机制、 源于转基因的双向克隆形成的发夹RNA(hpRNA)和反义RNA (asRNA)等克隆技术均可产生dsRNA[3]，dsRNA被Rde21、Rde24编码的蛋白识别并引导后，可被二聚体活性形式的Dicer酶从两端降解成21～23个核苷酸的siRNA[4]。

1.2 维持阶段 siRNA与RNA酶形成复合体即RNA诱导沉默复合体(R ISC)，后者具有RNA同源性寻找活性和解旋酶活性以解旋dsRNA，该复合物可被解旋的siRNA激活，鉴别单链siRNA序列和降解互补的转录产物[5]。生化研究表明，多种蛋白因子涉及RISC的形成。Hannon等报道，在果蝇S2细胞中分离了500 kD的RISC，但没有活性，而且他们发现，即使最纯活性形式的R1SC在体外也不具有靶mRNA的切割能力[6]。提示RISC作用的发挥还需要其他蛋白因子的参与。

1.3 信号放大与传播阶段 siRNA特异性地与mRNA结合后，siRNA作为引物在RNA依赖的RNA聚合酶作用下通过类似PCR的扩增作用再次形成dsRNA，新的dsRNA又被RNaseE样的Dicer内切酶切割产生次级siRNA，次级siRNA又可以进入下一轮循环。上述形成的siRNA作为信号被鉴别，在RdRp引导下， siRNA作为 dsRNA扩增的诱发子并以ssRNA作模板，将沉默反应放大、增强，在这个过程中，siRNA可能作为一种信号分子在植株中系统传播，诱导更多细胞启动PTGS，进一步放大PTGS效应[7]。

2 RNA干扰在动物繁殖中的应用

在动物繁殖领域，RNAi技术主要应用于研究动物生殖细胞发育和动物胚胎发育过程中重要的基因功能及其作用机制。

2.1 RNAi 与动物的生殖细胞发育 Wianny等首次将RNAi技术应用于小鼠卵母细胞研究中，选取在卵泡中表达的c-mos基因作为靶基因，通过显微注射方式导入dsRNA，结果与对照组基因敲除小鼠实验结果完全相同，即c-mos基因表达被抑制，细胞减数分裂停滞在MⅡ期，说明RNAi可以用于哺乳动物细胞基因功能研究[8]。Jin Han等用RNAi技术证明了Wee1B蛋白在小鼠卵母细胞中特异性表达，Wee1B蛋白是小鼠卵母细胞中关键的特异的促成熟因子(MPF)抑制激酶，是维持减数分裂中止所必需的[9]。Shaoji等首次将RNA干扰技术应用于精子的生成过程中，用电穿孔法向小鼠睾丸内导入外源的报告基因，然后用同样的方法导入包含siRNA的DNA载体， 发现报告基因的表达量在各个时期均有不同程度的降低，进一步用RNAi 技术沉默小鼠精母细胞形成过程中编码DNA重组酶的内源性DMC1(Disruption ofMeiotic Control)基因，显示DMC1基因沉默后，精母细胞发育停滞、不育[10]。

2.2 RNAi与动物的胚胎发育 在发育过程中的不同阶段，特异性地消除基因的功能是RNAi 最大优点之一。Wianny等构建了转基因小鼠检测体系，该体系在延伸因子-1a(ET-1a)启动子调控下表达修饰型绿色荧光蛋白(MmGFP)，将MmGFP的dsRNA注入单细胞受精卵，体外培养3～4d后，发现未注射dsRNA的胚胎中大量表达GFP，而注射组只有6.8%表现出微弱的荧光，说明dsRNA可以抑制GFP的表达；但在注入c-mos和E-cadherin的dsRNA单细胞受精卵中，GFP表达并不受影响，说明dsRNA具有抑制的特异性。Haraguchi等在小鼠受精卵原核中注射Oct4基因的 siRNA表达载体，体外培养到囊胚期阶段检测到Oct4基因mRNA和蛋白质表达水平的下降，且胚胎发育阻滞在囊胚期[11]。

3 RNA干扰在动物传染病预防上的应用

3.1 RNAi与口蹄疫的预防 Kahana R等[12]利用生物信息学的方法分析了所有已发表的FMDV序列，设计出3个至少22bp的siRNA片断，对所有FMDV都具有100%亲和性。应用实时定量PCR检测感染细胞中病毒RNA的总量，表明利用siRNA处理的细胞病毒增殖被抑制。当利用3种siRNA的混合物处理细胞时，对病毒的生长产生100%的抑制作用。Liu M等[13]证实，转染siRNA后12h内可以使BHK221细胞系FMDV的效价下降10倍～1000倍，且可持续到转染后第6天。用高感染复数FMDV接种L基因的siRNA表达盒转染的BHK细胞，24h后用间接免疫荧光方法检测。结果表明，表达载体极大地抑制了口蹄疫病毒在BHK细胞中的复制，该抑制作用具有序列特异性，并降低了BHK细胞的死亡率。

3.2 对流感病毒的干扰作用 PA/ PB基因、NP基因所编码的蛋白同样是病毒复制所不可或缺的因素，选取NP基因和聚合酶基因(PA/PB)中保守序列设计的siRNA，对鸡胚和细胞系中A型IV都有显著抑制作用。使用这些siRNA处理的感染小鼠，IV感染后肺组织中病毒效价明显降低，并能保护小鼠免于致死量病毒的攻毒[14]。siRNA能保护动物耐过H5/H7等高致病性亚型流感病毒的侵袭。这些结果说明了RNAi是一种控制流感的有效措施。M蛋白参与病毒粒子的装配和病毒进出细胞的质子通道，慢病毒载体能有效地将M1基因的siRNA转染到细胞内，造成M1蛋白在转染细胞内的表达抑制，将其与运载工具一起静脉注射到小鼠体内可以产生良好的RNAi作用。

4 RNA干扰在抗动物寄生虫上的应用

疫苗接种被认为是控制寄生虫的最有效和最持久的根本策略，使用肠道源的分子来构建疫苗抗原已经有效地用于家畜的外寄生虫，如目前投入市场并商品化用于免疫防治牛的重要吸血性蜱微小牛蜱的Bm86基因工程疫苗。利用H11[15]以及H-gal-GP[16]复合物来免疫防治捻转血矛线虫病的策略也非常有效，免疫保护率高达95%。RNAi技术的出现为抗寄生虫药物有效靶点的筛选和研究新的疫苗开辟了新的途径。Marcel o等[17]用RNAi研究布氏锥虫的Trys基因，发现Trys被抑制后，T(SH2)和GSP被消耗，GSH积聚，细胞H2O2明显增加，同时伴随着发育和繁殖受损，因此认为Trys可成为抗锥虫药物作用的一个靶点。

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