南瓜多糖提取分离纯化及其抗氧化活性的研究进展＊

孙 婕,尹国友,张 华,陈兰英,朱艳青,李文建,姬晓娜

(1.河南城建学院生物工程系,河南平顶山467036;2.哈尔滨工业大学食品科学与工程学院,黑龙江哈尔滨150090)

南瓜为葫芦科南瓜属一年生蔓性草本植物,其营养成分丰富,具有很高的食疗保健作用[1-2]。而南瓜中的多糖具有降血脂、降血糖、防癌等多种功能[3]。对南瓜多糖的研究及相应功能食品的开发逐渐受到重视,其中南瓜多糖抗氧化活性的研究是人们普遍关注的问题之一。文章对南瓜多糖的提取、分离纯化方法及对其抗氧化活性的研究做一综述。

1 南瓜多糖的提取方法

1.1 热水浸提法

由于多数多糖在热水中的溶解度较大且性质稳定,热水浸提法是提取多糖最常用的方法。李俊丽[4]等采取热水浸提法对南瓜多糖的提取进行了研究,提取工艺的最佳条件为：1∶40的料液比,在70℃水浴条件下提取3次,每次提取4 h。向东[5]等在用热水提取南瓜多糖的研究中发现,热处理对致密的南瓜组织有疏松作用,从而使细胞内的多糖更容易浸提出来。热水浸提法是一种常用的提取植物多糖的传统方法,操作简便,所得多糖生物活性好,但多糖得率低,费时费工。

1.2 碱法提取法

由于碱液能减弱植物细胞壁分子间的作用以增加多糖的提取率,所以碱法也常用于提取多糖。向东[6]等采取碱法提取法提取南瓜多糖,得出最佳的提取工艺条件为：提取温度80℃,提取时间2 h,液固比5∶1,NaOH浓度0.4 mol/L。碱处理对致密的南瓜组织有疏松作用,能提高多糖的提取率,但由于在碱液的作用下还原糖会因发生反应使获得的南瓜提取液色泽较深,呈棕色,很难除去。

1.3 超声提取法

超声提取法是利用超声波的热效应、机械效应和空化作用破坏细胞,使水溶性多糖更易提取。赵二劳[7]等采用超声提取法对南瓜多糖的提取进行了研究,得出最佳的提取工艺条件为：以水为提取剂,预浸时间10 min,超声作用时间20 min,提取温度60℃,超声波功率80 W,占空比1,此时多糖的提取量最大可达42.6 mg/g。孙俊[8]等通过试验确定了超声提取的最佳工艺条件,并通过DPS分析软件建立了数学模型。超声提取能缩短提取时间,提高提取率,且得到的多糖生物活性性质也不会改变,但此方法难以扩大规模。

探究式学习模式[2]一般是先由教师选择和确立主题并在教学过程中创设问题情境，让学生能独立自主地发现问题，通过实践操作、搜集调查研究学习资源、互相交流学习体验来解决问题，通过这些探索活动来获得知识和培养能力，从而发展情感与态度，特别是探索精神和创新能力.它倡导学生主动参与到学习中来，是一个积极的学习过程，换句话说，是让学生自己思考怎么做、做什么，而不是让学生接受现成的结论.探究式学习模式的学习特点在于自主性、实践性、综合性和开放性，是一种多层面的学习活动[3].

1.4 复合酶提取法

南瓜多糖及其衍生物具有很好的抗氧化性能,对不同的自由基的清除能力不相同。同样,不同成分的南瓜多糖对同一种自由基的清除能力也不相同。因此,清除某种自由基要找到对其具有最大清除能力的南瓜多糖成分。

1.5 其他方法

赵二劳[11]等研究了南瓜多糖的微波提取,确定了优化条件,此方法具有快速、节能、操作简便、提取率高且对生物活性无影响等优点。向东[12]等通过对超声波提取和缓冻法提取的比较,发现缓冻的效果优于超声波。缓冻可以使植物细胞内产生冰晶,使细胞组织易受伤破碎,能强化多糖的提取。此外,还有有机溶剂沉淀法等。

提取得到的南瓜多糖液一般先需要经过醇沉,醇沉时要考虑乙醇的用量。张涛[13]等对不同乙醇用量对南瓜多糖沉淀量的影响进行了研究,得出样液与乙醇溶液的体积比1∶5为沉淀南瓜多糖的乙醇用量。熊冰[14]等也做了同样的研究得出相同的结论。杨宁[15]等在野仙人掌多糖抗氧化性的研究中发现,使用不同浓度的乙醇得到的多糖对其抗氧化性也会产生一定的影响。

2 南瓜多糖的分离纯化方法

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醇沉得到的多糖要经过脱蛋白、脱色、透析等操作。南瓜多糖脱蛋白的常用方法有：Sevag法[16]、三氯醋酸(TGA)法[17]等。向东[18]等在用活性炭对南瓜粗多糖液脱色试验中确定了活性炭脱色的最佳工艺条件。而吴国欣[19]等则采用H2O2法对提取的南瓜多糖液进行脱色。方积年[20]等认为,活性炭脱色时,由于活性炭对多糖也有较强的吸附作用,会使多糖损失很大,推荐使用H2O2法脱色,但必须严格控制脱色条件,如多糖溶液的浓缩、温度、时间、pH等。透析是用于除去粗多糖中的小分子杂质,提取南瓜多糖时用于调节pH的缓冲试剂也会在醇沉时沉淀下来,必须通过透析等操作除去。

多糖纯化的方法还有分步沉淀法、盐析法、超离心法、电泳等[20],其中盐析法中的季胺盐沉淀法常用于分离酸性多糖及中性高分子量多糖,但目前用于南瓜多糖的较少。

近年来,人们对多糖及其衍生物的抗氧化活性作用有了越来越深入的认识。自由基产生过量就会对机体造成损害,导致癌症、动脉硬化、衰老等一系列相关疾病,而抗氧化剂的抗氧化作用可以通过抑制自由基的产生或直接清除自由基等来实现[26-29]。李俊丽[30]等采用水杨酸法检测羟基自由基(◦OH),过硫酸铵/N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(AP-TEMED)法检测超氧阴离子)研究了南瓜多糖清除◦OH和的效果,结果表明：南瓜多糖有很好的抗氧化性,对◦OH具有很好的清除能力,随着多糖浓度的增加◦OH清除率增大,对也有一定的抑制作用,也是随着多糖用量的增加清除率上升,但与清除◦OH的能力相比,要相对弱一些。多糖结构中的醇羟基可以与产生◦OH等自由基所必需的金属离子(如Fe2+、Cu2+等)络合,使羟基自由基的产生受到抑制[31]。

由于传统的水提醇沉等连续操作只是局限于实验室阶段,可实现工业化生产的不多。随着科学技术的发展,一些新的提取纯化方法得以应用。吴建中[21]等研究了超滤技术在南瓜多糖浓缩纯化过程中的应用,得到了南瓜多糖的最佳超滤条件,钟俊桢[22]等运用AB-8型大孔吸附树脂纯化南瓜多糖,确定了纯化的最优条件,整个工艺流程较简单,也节省能量,适合工业化生产南瓜多糖。

3 南瓜多糖的抗氧化活性

南瓜多糖的分离纯化关系到其结构鉴定和药效评价,也是进行结构与活性关系研究及药效、药理研究的基础。所以需要对得到的粗多糖进行高度纯化及对其组分、结构等进行研究。目前,对于南瓜多糖的纯化一般是通过柱层析的方法,而使用较多的是阴离子交换柱层析和凝胶柱层析等。孔庆胜[23]等将粗多糖经Sephadex G-100柱层析纯化,得到南瓜多糖纯品(Pumpkin Polysaccharide,PP),并用聚丙烯酰胺凝胶电泳证明为均一体。凝胶过滤法测得其分子量为1.6×104。PP用酸完全水解,经纸层析表明由D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖、木糖和D-葡萄糖醛酸组成,其摩尔比分别为6∶3∶2∶1∶6。孙静亚[24]等将透析得到的粗多糖,通过DEAE-Sepharose和SephadexG-100柱分离纯化得到两种水溶性多糖,经酸解、纸色谱分析得组分1的单糖组成为D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖和葡萄糖醛酸,组分2的单糖组成为D-葡萄糖、D-半乳糖和葡萄糖醛酸。张凡华[25]将南瓜粗多糖通过DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析和sephacryls-100 HR凝胶过滤层析得到南瓜低分子量多糖(LWPP-Ia),通过高效液相色谱测定了LWPP-Ia的纯度,显示为单一峰,分子量为6267Da,运用高效液相离色谱测定了单糖组成,紫外扫描显示无蛋白、核酸杂质,红外光谱鉴定表明,其含有多糖的特征吸收峰,并含有吡喃糖环。

多糖的抗氧化作用与其结构有关,从一种海产丝状真菌(Phoma herbarum YS4108)中提取的多糖经硫酸化修饰后可产生较强的抗氧化和自由基清除活性作用[33]。Tsiapali[34]等研究了葡聚糖及其衍生物的抗氧化活性,结果表明：磷酸化和硫酸化的葡聚糖的抗氧化性比葡聚糖强。南瓜多糖的生物活性与其自身的结构有关,当其结构变化时,多糖的生物活性也会发生变化。谢佳[35]等对南瓜粗多糖和分离得到的南瓜AP1多糖进行硫酸酯化,采用邻二氮菲-金属铁离子-H2O2体系和邻苯三酚自氧化法,测定南瓜多糖对◦OH和O2-的清除作用,结果表明：四种南瓜多糖均能有效清除◦OH,并随着浓度的增加,清除作用加强,且水提南瓜粗多糖对◦OH清除作用显著高于其它三种多糖,而南瓜粗多糖和南瓜AP1多糖对O2-的清除作用不明显,经硫酸酯化后的多糖能有效清除O2-,并呈量效关系。

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不同的提取方法得到的南瓜多糖的抗氧化活性也不相同。柳红[32]等对热水浸提法和超声辅助法提取的南瓜粗多糖,用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)络合沉淀得AP1多糖,用邻二氮菲-金属铁离子-H2O2体系检测南瓜多糖对◦OH的清除作用,结果表明：得到的南瓜多糖都能有效清除◦OH,且热水提取的南瓜多糖对◦OH的清除作用显著高于超声提取的南瓜多糖。

选择合适的酶,可温和地将植物组织细胞壁分解,以有利于多糖的释放,提高提取率。常用的酶类有纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶等。王洪伟[9]等采取复合酶法对南瓜多糖的提取进行了研究,结果表明,复合酶法提取南瓜多糖的提取率得到很大提高达28.8%。徐雅琴[10]等将热水浸提法、超声波法和复合酶法进行了比较,得出复合酶法多糖提取率最高,得到的粗多糖色泽好,蛋白质含量低。复合酶提取法是一种较为有效的提取方法,分解了细胞壁使多糖更易提取,且可以降解蛋白质,具有条件温和、杂质易除和得率高等优点。

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目前,在南瓜多糖抗氧化性试验中,研究较多的就是清除各类自由基的能力的检测,而抗氧化试验中的硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)法[36]、总抗氧化能力的测定(The Ferric Reducing ability of plasma,FRAP)[37]及还原力的测定[38]等在南瓜多糖抗氧化性研究中的应用较少。

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4 展望

植物多糖具有广泛的生物活性,多糖作为保健食品的主要成分已悄然兴起。多糖具有独特的生物活性,且无毒副作用,这有利于扩展其在保健品、功能性食品中的应用。南瓜多糖的降脂、降糖、防癌等多种活性已得到认证。

丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)等人工抗氧化剂,虽然抗氧化效果很好,但对人体都一定的毒性[39],南瓜多糖具有的抗氧化活性则使其在作为天然抗氧化剂和功能性食品方面有望得到开发利用。优化南瓜多糖的提取方法、确定其最佳提取工艺条件、南瓜多糖的生物活性机制及应用、研究南瓜多糖活性与结构的关系并加以有效的改造,使之增强原有的活性等都是目前的研究热点。随着对南瓜多糖研究的深入,利用南瓜多糖来开发的保健食品的市场前景被人们看好。

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