哺乳动物核移植研究进展

宁方勇，王 星，杜智恒，杨春山，白秀娟

（1.东北农业大学 动物科技学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.辽东学院农学院，辽宁 丹东 118003）

哺乳动物核移植研究进展

宁方勇1，王 星2，杜智恒1，杨春山1，白秀娟1

（1.东北农业大学 动物科技学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.辽东学院农学院，辽宁 丹东 118003）

哺乳动物核移植（Nuclear Transplantation，NT）是目前生物技术领域研究的热点之一，其科学意义和应用价值重大。本文根据近年来国内外的研究进展，对核移植技术步骤、核移植研究概况及目前核移植研究中存在的问题作一综述，希望能够对从事核移植研究的同行有所帮助。

哺乳动物；核移植；研究进展

哺乳动物核移植就是人们通常所说的动物克隆，是指通过显微操作的方法，从早期胚胎分离一个卵裂球或分离一个培养的体细胞，通过显微操作仪将其注入到去核卵母细胞的胞质或透明带下，重新组建一个新的胚胎。这个胚胎称为重组胚或克隆胚。克隆胚被激活后，供体细胞DNA可以像正常受精卵一样，经细胞分裂，分化并在母体内发育成一个新的个体[1]。新个体具有与供体完全相同的基因型，即新个体具有与供体完全相同的遗传物质。因此，核移植技术在动物育种、制备转基因动物、基因治疗和器官移植等方面具有重大作用[2]。哺乳动物核移植技术可以根据供核细胞的不同分为胚细胞核移植和体细胞核移植两类。

1 哺乳动物核移植的主要步骤

哺乳动物核移植技术包括一系列复杂程序：供体细胞的选择与体外培养、卵母细胞的体外成熟及激活、去核、细胞核移植、融合-激活、重构胚的体外培养和胚胎移植。

1.1 供体细胞的选择与体外培养

用于核移植的细胞有多种，最早采用早期胚胎的卵裂球，在1997年Wilmut等报道“多莉”羊之前主要是以此类细胞作为供核。这些细胞具有全能性或多能性，相对来说核移植的成功率高[3]。目前用于核供体的主要有卵丘细胞、睾丸支持细胞、精子细胞、脑细胞、胎儿或成体成纤维细胞、胚胎干细胞（ES细胞）等[4]。供体与受体细胞的细胞周期发育同步化是影响核移植成败的一个重要因素，早期的研究认为供体细胞处于G0期[5]是体细胞核移植成功所必需的，并指出可通过选择细胞类型或人工诱导两种方法来获得G0期细胞。然而近来发现，未经休眠诱导的G1或G2甚至M期供体细胞的核移植也均获得了成功[6]。与此同时，研究还发现在小鼠的核移植中供体细胞的类型和基因型对移植效率也有较大影响[7]。

从目前的研究来看，似乎应用处于各个细胞时相的细胞都能得到克隆动物，但还没有一种伴随核移植动物出生的细胞周期专一性标记物来证明核移植所得后代来源于某一个特定细胞时相[8]。因此深入研究供体细胞类型、细胞周期、同步化处理方式以及细胞的倍增时间等在核移植胚胎发育过程中所起的作用显得异常重要。

1.2 卵母细胞的体外成熟及激活

1.2.1 卵母细胞的体外成熟

体细胞核移植中体细胞必须在去核的卵母细胞内进行重编程，以恢复其全能性，而卵母细胞的成熟程度则会直接影响体细胞的重编程过程。所以卵母细胞的体外成熟，作为体细胞核移植过程中的一个关键环节而为人们所关注。

目前关于哺乳动物卵母细胞的体外成熟还存在很多的问题，有人提出将卵母细胞的成熟分为3个方面：核的成熟、胞质的成熟、分子的成熟。目前对卵母细胞的成熟的判断只是通过形态学上的观察，或者通过对囊胚率、受孕率及产仔率来进行验证性地判断，而要从根本上解决卵母细胞的体外成熟问题，还要加强对于卵母细胞成熟机制方面的研究[9]。

1.2.2 卵母细胞的激活

自然状况下或体外受精时，精子的进入会启动停滞于MⅡ期的卵母细胞继续发育，这一过程称为卵母细胞的激活。以成熟卵母细胞为受体的核移植中，由于缺乏诸如受精等自然的过程，故必须对卵母细胞进行人工激活以促使其进一步发育。一些物理或化学因素也可以使卵母细胞活化。目前应用较多的激活方法有电激活、乙醇、离子霉素、氯化锶、三磷酯酰、精子提取物激活等。

1.3 去核

在细胞核移植研究中，去核这一步非常关键。采用的去核方法主要有半卵去核法、功能性去核法、离心去核法、化学去核法、挤压去核法、点压去核法和蔗糖辅助去核法等，但目前使用较多的仍然是盲吸收去核法和活性荧光染色去核法。

1.4 细胞核移植

供体核的移植主要有融合和注射两种方法，融合包括化学融合、仙台病毒融合与电融合，目前采用较多的是电融合。注射包括微细玻璃针和piezoelectric显微注射两种，均有成功的例子。

1.5 融合-激活

目前采用的融合-激活方案有3种：（1）融合前激活，即在卵母细胞与供核体细胞融合前激活卵母细胞；（2）融合时激活，即在将供受体融合的同时激活卵；（3）融合后激活，即在供受体融合后数小时再激活，可延长核在受体胞质内的时间，使重编程更彻底[10]。

1.6 重构胚的体外培养和胚胎移植

重构胚需一定时间的培养，方可移植到受体。家兔和猪重构胚在体外培养24 h以内，就可通过非手术移植，而羊和牛重构胚所需培养时间较长，一般发育到囊胚或桑椹胚时移植。培养的方法是可将电融合的重构胚放入10%FCS的RD微滴内培养，也可将显微操作的胚胎移入同种或异种的输卵管中进行培养几天后冲洗输卵管，回收重构胚[11]。核移植重构胚成功发育取决于一系列的因素，如卵子的质量、重构的程序、培养的条件、受体和供体细胞的细胞周期阶段等。前面几个因素都是实验技术方面的问题，受体和供体细胞的细胞周期阶段则是涉及到核质相互关系问题，这是取决于重构胚成功发育最关键的因素之一。

在体外进行重构胚的培养时选择适当的培养液非常重要。重构胚的移植与胚胎移植的方法基本一样，即根据受体动物的不同可分为手术移植和非手术移植。

2 哺乳动物核移植的研究现状

1997年，世界上第1只成年绵羊乳腺上皮细胞核移植后代Dolly的诞生，标志着核移植技术进入了一个崭新的发展阶段。这一成就具有划时代的意义，而且进一步证实了基因活性学说的正确性，证明高度分化的体细胞仍然具有基因组的等同性，其细胞核仍然具有支持哺乳动物全程发育的全能性。

2.1 哺乳动物核移植细胞类型

核移植所用细胞包括动物干细胞、胎儿体细胞和成年体细胞等，由于建立大动物和人的干细胞系比较困难，因此目前的核移植研究多用后两种细胞。此后，以不同动物不同组织来源的体细胞进行核移植均得到了后代，这些细胞包括颗粒/卵丘细胞、鼠尾尖细胞、乳腺细胞、皮肤成纤维细胞、输卵管和子宫上皮细胞、转染或未转染的牛生殖嵴细胞、牛肌肉细胞、牛初乳乳腺上皮细胞、肺组织细胞、兔成纤维细胞等。

2.2 哺乳动物的核移植研究

自从1997年Willmut等利用成年绵羊乳腺细胞作为供核细胞，获得体细胞克隆羊Dolly后，哺乳动物的核移植研究在全世界范围内广泛开展，并陆续获得了多种动物的克隆后代。1998年，Wakayama等得到克隆的再克隆小鼠。1999年，Baguisi等获得克隆山羊。2000年，Polejaeva等和Onishi等获得克隆猪。2002年，Chesne等获得克隆兔。2002年，Shin等获得克隆猫。2003年，Galli等获得克隆马。2003年，Zhou等获得克隆大鼠。

2.3 哺乳动物的异种核移植研究

1992年Wolf等人进行了将牛胚胎细胞核移入水牛、山羊、绵羊和仓鼠去核卵母细胞中的实验。1993年，梅祺等进行小鼠与兔的胚胎细胞核移植。1998年，Wells成功利用普通牛卵母细胞和1头珍稀印度野牛体细胞获得成活的异种克隆后代。2001年，美国ACT公司获得了1头野牛与家牛的异种克隆后代，这头野牛是世界上第1头采用异种克隆技术克隆的哺乳动物，虽然该野牛在出生后2天死亡，但是证明了哺乳动物体细胞可以在异种动物卵母细胞内完成核发育程序重编、去分化完成整个发育过程。同年Loi P等用欧洲盘羊的颗粒细胞为供体，移植到去核的绵羊的卵母细胞为胞质受体构建异种克隆胚，移植给代孕的母羊生产出1只具有明显欧洲盘羊外貌特征的后代。2002年中国科学院动物研究所将处于2～4细胞期的大熊猫-兔异种克隆胚胎和猫-兔克隆胚胎一起移植到处理过的家猫输卵管内，得到的克隆胎儿中有两个来源于大熊猫异种重构胚。2003年冯秀亮等证明猪成熟MⅡ期卵母细胞可以对人体细胞核进行重新编程，并可支持其发育到囊胚阶段。2004年SansinenaMJ等将爪哇野牛-牛异种克隆胚胎体外培养囊胚期移植给代孕的母牛体内，其中1只妊娠维持到30～60 d，1只在60～90 d妊娠终止。2005年彭涛等发现盘羊-绵羊异种克隆胚胎和北山羊-山羊异种克隆胚胎移植入代孕母羊子宫内能够着床发育。2006年报道我国在人-山羊种间核移植试验中没有获得囊胚，但是山羊的卵母细胞可以支持人体细胞完成重编程，重构胚在体外可以完成早期发育[12]。

应用核移植技术获得的动物大多是亚种间的核移植，但是已经可以证明异种动物间的核移植技术的可行性。

3 哺乳动物核移植存在的问题

哺乳动物核移植技术虽然在生物医药、农业以及其他领域的应用取得了一定进展，但目前核移植技术还不够完善。存活率和异常发育是当今核移植技术的最大缺陷，同体外受精相比，效率低是目前核移植技术应用发展中普遍存在的现象。需要在理论和实践上得到进一步提高。主要表现在囊胚发育率不稳定、移植后受胎率低、出现畸胎、死胎、流产以及出生后早亡率高。对造成效率低的原因意见不一，有人认为是培养条件未达到最佳化，也有人认为是细胞的问题。如细胞遗传物质受到损伤，细胞没有完成发育程序重排或者由于遗传印迹造成关键基因没有充分表达等。即使是出生的个体也经常出现一些异常，如胎盘过大、胎儿过大及呼吸系统疾病等。导致这些现象的原因很多，如卵母细胞质量、供核细胞的种类、核质互作关系、供核重新编程、操作水平、培养条件和外界环境等。

尽管目前来看，哺乳动物核移植仍然面临很多问题，哺乳动物核移植技术自身仍在不断完善中。但相信随着分子遗传学、细胞学、发育生物学等相关基础学科的进一步发展，哺乳动物核移植将在未来的生物学及人体器官移植等方面扮演重要角色。

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S814.8

B

1005-2739（2010）01-0009-03

2009-09-21

宁方勇（1977-），男，讲师，硕士。

白秀娟，女，教授。