犬卵母细胞体外成熟的研究进展

王伦学，李 力，谷颖东，徐永莉，张月云，赵成坚

（中国医学科学院药用植物研究所广西分所 广西药用植物园，广西 南宁 530023）

犬卵母细胞体外成熟的研究进展

王伦学，李 力，谷颖东，徐永莉，张月云，赵成坚

（中国医学科学院药用植物研究所广西分所 广西药用植物园，广西 南宁 530023）

阐述了影响犬卵母细胞体外成熟的各种因素，总结概括了目前新的培养方法，并对国内的研究现状及前景作了思考，以期为研究犬卵母细胞体外成熟研究提供参考。

犬；卵母细胞；减数分裂；体外成熟；辅助生殖技术

目前，犬卵母细胞体外成熟效率很低[1-13]。据报道，犬卵母细胞恢复减数分裂比例为0～58%，而发育至MⅡ期比例平均为20%[14]。犬卵母细胞体外成熟所采用的培养液大多借鉴其它家畜动物，如猪和牛的体外成熟系统，而很少研究考虑犬种属特异性。犬体外成熟体系与其它哺乳动物相比仍不完善，这可能与犬卵母细胞具有不同的体外成熟机理有关。目前已有较多报道尝试采用不同培养基，在其中添加蛋白质、黏多糖及输卵管上皮细胞共培养，但卵母细胞体外发育至MⅡ期比例仍无大幅度提高。因此，若要发展犬体外受精和胚胎发育等辅助生殖技术，必须提高犬卵母细胞体外成熟效率。本文综述了影响犬卵母细胞体外成熟因素及目前采用的培养方法，为深入探索优良的体外培养体系作参考。

1 影响因素

1.1 卵母细胞质量和直径

研究发现，犬卵巢中存在很高比例（20%～68%）的退化卵母细胞[13]。Farstad W等在1993年发现高达68%的犬卵母细胞发生形态退化，不能用于体外成熟。可能与犬年龄及发情周期及卵母细胞分离方法有关。犬卵母细胞多数采用手术刀片切碎卵巢组织而分离获得，卵母细胞多数是从卵巢组织内卵泡中获取的。分离过程中可能对卵泡和卵母细胞结构有机械损伤。另外，从屠宰场或宠物医院获取的犬卵巢多数处于间情期，卵巢表面充满皱褶且无明显卵泡。卵母细胞全是从卵巢内卵泡中分离到的，分离出的卵母细胞多数已发生退化，可用于体外成熟的卵母细胞数量有限。仅少数研究抽吸卵巢表面卵泡中卵母细胞用于研究，用此方法获取的卵母细胞质量较高。所以卵母细胞数量和质量是制约犬卵母细胞体外成熟进展的重要因素[15]。

在其它哺乳动物研究中发现，卵母细胞减数分裂成熟能力与卵泡直径[16-19]和卵母细胞直径有关[20，21]。目前，Hewitt和England发现直径最大组（＞100μm）卵母细胞成熟能力大于直径中等组（100μm），直径中等组卵母细胞成熟能力大于直径小组（＜100μm）。T Otoi等在2000年研究发现，直径大于等于120 μm组卵母细胞发育至MⅡ期达到21.5%，显著高于直径小于100 μm组（0%）以及直径为100～120 μm组（4.9%）[22]。此研究表明卵母细胞减数分裂能力与卵母细胞直径大小成正比。此研究同时发现直径小于100 μm的卵母细胞不能发育至MⅡ期，而卵母细胞直径达120 μm才具有减数分裂能力。这表明卵母细胞直径可作为衡量体外成熟（IVM）效率的一个重要指标。另外，卵母细胞减数分裂能力可能与培养体系有关。而目前体外培养体系不成熟及成熟效率普遍低下，因此很难评估不同直径卵母细胞体外成熟能力。

N Songsasen[23]从直径小于2 mm卵泡中获取卵母细胞，卵丘细胞为2层或以上并且细胞质黑而均匀的卵母细胞用于体外成熟。分离出的卵母细胞直径可达120 μm，与体内的卵母细胞直径相同[24]，并具有充分的发育能力。但是，卵母细胞体外成熟却停滞在第1次减数分裂中期（MⅠ），他们推测这与卵泡直径有关，而与卵母细胞直径无关。此研究表明从直径大于2 mm卵泡中获取卵母细胞用于体外成熟是最佳选择。

1.2 供体因素

1.2.1 生殖周期

多数报道认为，犬卵母细胞成熟能力与生殖周期无关[25-28]。其中，DAHewitt和GCWEngland发现发情前期和发情期之间，以及间情期和发情后期之间卵母细胞体外成熟能力差异不显著[25]。M Hishimuma等研究发现，发情间期（8.8%）和子宫积脓期（6.0%）卵巢中卵母细胞体外成熟72 h后，发育至MⅡ比例差异不显著。Berenice de Avila Rodrigues等报道从子宫积脓期卵巢获取的1级和2级卵母细胞发育至MⅡ期的比例与其它生殖周期相似[29]。其中子宫积脓期卵母细胞发育至MⅡ期比例低至10%，这与其他几篇报道结果类似[10，11，27，28]。另外，Berenice de Avila Rodrigues[28]发现各生殖周期间卵母细胞发育至MⅡ能力差异不显著[28]（卵泡期：5.4%；间情期：4.2%；发情后期：4.4%；子宫积脓期：8.1%；妊娠期：4.7%），恢复减数分裂能力（GVBD-MⅡ）之间亦差异不明显（卵泡期：24.6%；间情期：19.6%；发情后期：16.4%；子宫积脓期：37.1%；妊娠期：29.2%）。

仅有少数研究发现犬卵母细胞成熟能力与生殖周期有关。MK Kim等在体外成熟液中添加17β-雌二醇（E2）和孕酮（P4），检测其对犬卵母细胞成熟的影响[30]。卵泡期卵母细胞在添加2μg/mL的17 β-雌二醇的TCM-199成熟液中培养后，发育至MⅡ比例（14.7%）显著高于（P＜0.05）发情后期（5.6%）和间情期（5.6%）卵母细胞，并且也显著高于其它组（1.5%～8.2%）。表明不同发情周期卵母细胞体外成熟能力与成熟液成分有关。

1.2.2 月份和季节

Nucharin Songsasen等统计各季节（春季：3～5月份；夏季：7～8月份；秋季：9～11 月份；冬季:12至次年2月份）卵母细胞成熟能力，其发育至MⅡ比例分别是 20.8±4.7%，20.5±2.8%，23.8±4.7%，17.8±5.2%。此研究表明月份和季节不影响狗卵母细胞体外成熟能力（P＞0.05）[31]。

1.2.3 年龄

D A Hewitt等比较不同年龄犬卵巢中卵母细胞成熟能力大小[32]，发现1～6岁犬卵母细胞恢复减数分裂能力（67%）大于7岁或年龄更大组（34%），同时1～6岁犬卵母细胞完成核成熟能力（MI/AI/MⅡ：25%）亦大于7岁或年龄更大的（4%）。随年龄增大，卵巢组织更加老化，其卵母细胞质量越低，卵母细胞减数分裂能力越小。若要提高犬卵母细胞体外成熟效率，需优先选择年龄较小犬的卵巢组织中卵母细胞。

1.3 激素

1.3.1 孕酮

孕酮（P4）是多数哺乳动物卵母细胞成熟促进因子。已有较多研究表明孕酮对卵母细胞成熟有积极或消极作用。如Gould和Graham研究发现孕酮能促进恒河猴卵母细胞体外成熟至MⅡ能力[33]。而DeMarais和Racowsky发现孕酮对仓鼠卵母细胞成熟有抑制作用[34]。另外，有研究发现，高浓度孕酮使小鼠卵母细胞处于减数分裂停滞状态[35]。

有关孕酮对犬卵母细胞成熟作用研究不多，且不同研究所得结论不一致。如Hewitt在体外成熟液中添加1.0μg/mL孕酮，能促进犬卵母细胞减数分裂恢复能力[5]。而Willingham-RockyLA等发现添加高浓度孕酮（从0～8 000 ng/mL），对犬卵母细胞减数分裂恢复以及核成熟都没有显著促进作用[36]。MKKim等发现孕酮能刺激（P＜0.05）犬卵泡期卵母细胞体外核成熟至MⅡ能力[30]。同时发现，含E2（2μg/mL）的培养液中添加孕酮（0～2.0μg/mL）与单独添加E2相比，能进一步促进或抑制卵母细胞核成熟。其中低浓度孕酮（0.5μg/mL）显著降低卵母细胞发育至MⅡ能力（3.4%），而高浓度孕酮（2μg/mL）能显著促进卵母细胞发育至MⅡ能力（16.6%）。此研究表明，孕酮对犬卵母细胞成熟作用可能依赖于很多因素，如培养基中添加的激素。

1.3.2 hCG

Monica De los Reyes等采用分段培养方法研究hCG对犬卵母细胞体外成熟作用。此研究中分段培养即卵母细胞首先在含10 IU/mL的hCG培养液中培养48 h，然后在不含hCG培养液中继续培养48 h。研究发现，卵母细胞在含10 IU/mL的hCG培养液中持续培养96 h，其发育至MⅡ比例（MⅡ：33.1%）高于未添加hCG组（MⅡ：20.7%），但差异不显著。同时发现采用上述分段培养法，卵母细胞发育至MⅡ比例高达43.4%，明显高于对照组。此研究是犬卵母细胞体外成熟效率较高的报道之一[12]。但hCG对犬卵母细胞体外成熟作用机制仍不清楚。

1.3.3 eCG，FSH和LH

N Songsasen等发现犬卵母细胞在eCG中短暂处理能促进其发育MⅠ期及以后时期。他们把犬卵母细胞放置在eCG中处理60～240 min，能显著提高卵母细胞发育至 MⅠ-MⅡ比例（P＜0.05）[23]。其中，用0.5 IU/mLeCG处理60～240 min，有30%～44%卵母细胞发育至MⅠ-MⅡ，而对照组（无eCG处理组）仅有14%发育至MⅠ-MⅡ。但eCG处理120 min对照组相比，卵母细胞发育至GV，GVBD和MⅠ-MⅡ比例都差异不显著。作者认为这是由于不同重复实验中卵母细胞对eCG反映不同所导致的。

上述eCG对犬卵母细胞成熟促进作用机制没有研究清楚。eCG对犬卵母细胞成熟促进作用可能是通过FSH活性产生的。已报道小鼠和猪卵母细胞中FSH能刺激卵丘细胞分泌减数分裂刺激物质[37，38]而促进卵母细胞成熟。Byskov A G等发现小鼠卵母细胞在FSH中处理30 min能促进GVBD发生[37]，FSH作用24 h能促进减数分裂恢复和核成熟。但已有研究表明，在培养液中添加FSH/LH（单独或联合作用），都不能促进犬卵母细胞成熟[5，7，11]，这可能与促性腺激素作用导致雌激素/孕酮比例改变有关。Ding和Foxcroft发现成熟液中添加促性腺激素能改变猪颗粒细胞类固醇激素合成比例[39]，其中雌激素/孕酮比例改变。而成熟液中雌激素/孕酮比例变化能影响一些物种卵母细胞核成熟能力[7，39，40]。因此，建议下步实验可以研究犬卵母细胞在激素作用下（短暂处理或者较长时间作用）颗粒细胞合成激素浓度变化，以此来探索激素是如何影响犬卵母细胞成熟能力的。

1.4 卵丘细胞

在各种家畜动物中，卵丘卵母细胞复合体（COCs）中卵丘细胞扩展被认为是卵母细胞成熟的一个重要指标[41，42]。因此，卵丘细胞扩展可被认为是犬卵母细胞成熟的一个标志。但研究发现犬卵母细胞体外成熟时卵丘细胞很少发生扩展[43，44]，并且体内卵丘细胞和卵母细胞之间联系从受精至桑葚胚期持续存在[45]。已报道蓝狐卵母细胞体外成熟过程中卵丘扩展规律与犬相同，这可能是由于蓝狐与犬在亲缘关系较近。因此犬科动物卵丘扩展具有特殊性[11，46]，可能是由于其卵母细胞质成熟不充分[47]。多数研究发现犬科动物卵丘细胞扩展与卵母细胞成熟不成正比关系[11，46]。如Srsen等发现FSH能刺激狐狸卵母细胞中卵丘细胞扩展，但没有发现卵母细胞发育至MⅡ[46]。相反，在培养液中添加牛生长激素时卵丘细胞未发生扩展，但发现有40%卵母细胞已完成核成熟。另外，N Songsasen等发现生长因子（GH）能刺激犬卵母细胞中卵丘扩展[11]，但不能提高卵母细胞成熟效率。不同研究出现不同效果可能与不同犬科动物卵母细胞和卵丘细胞对生长因子反映不同有关。但有一篇文章报道随卵丘细胞扩展程度加大，成熟效率逐渐提高[12]。即Monica De los Reyes等在培养液中添加10 IU/mL hCG能显著刺激（P＜0.05）犬COCs中卵丘扩展，并且10 IU/mLhCG能提高COCs发育至MⅡ能力[12]。同时发现卵丘扩展在COCs培养96 h后卵丘扩展程度没有继续增强。

1.5 培养基、血清和能量

1.5.1 培养基

N Songsasen等研究无蛋白培养基中各种因子，能量对犬卵母细胞成熟作用。发现犬卵母细胞在无蛋白培养基中能完成核成熟[11]。同时发现不同培养基对犬卵母细胞成熟效率有显著差异（P＜0.05）。其中卵母细胞在TCM199培养基中成熟48 h有13%（6/121）发育至MⅡ，而在CMRL1066培养基中发育至MⅡ很低，在135枚卵母细胞中仅发现1枚发育至MII。

1.5.2 血清

Oh HJ等研究不同发情期犬血清对犬卵母细胞体外成熟能力作用[48]。发现卵泡期卵母细胞在含10%发情期犬血清（14.2%）成熟液中体外成熟72 h，发育至MⅡ比例显著高于（P＜0.05）其它组（5.2%；6.3%；FBS∶2.2%；2.2%）。同时10%发情期犬血清组（MⅡ∶13.5%）发育至MⅡ比例显著（P＜0.05）高于其它浓度组（5%∶1.3%；20%∶5.1%；对照∶2.7%）。因此，成熟液中添加10%发情期犬血清对犬卵泡期卵母细胞体外成熟是必需的。本人研究发现，屠宰场和宠物医院中获取的卵巢多数处在非卵泡期。为珍惜卵巢资源，建议在上述研究基础上，继续研究10%发情期犬血清对其它发情期卵巢中卵母细胞成熟效率影响。

1.5.3 能量

有报道表明，仅在培养液中添加葡萄糖作为能量，不能完全促进小鼠卵母细胞核成熟能力。如Downs和Mastropolo报道小鼠卵母细胞在仅含葡萄糖为能源的培养基中能恢复减数分裂[49]，但仅有很小部分卵母细胞排出第1极体，而在培养液中添加0.23 mmol/L丙酮酸盐能显著提高卵母细胞发育至MⅡ能力。上述研究结论可能对犬卵母细胞体外成熟适用。已有研究尝试在高氧（20%）条件下葡萄糖对犬卵母细胞体外成熟作用。发现高浓度葡萄糖（11.0 mmol/L）对犬卵母细胞核成熟有损害作用。但Hashimoto等发现在低氧浓度（5%）条件下，在含20 mmol/L葡萄糖成熟液中多数卵母细胞能发育至MⅡ[50]。因此，高浓度葡萄糖（11.0 mmol/L）可能促进卵母细胞核成熟，但前提是卵母细胞在低氧条件下成熟，可能是由于低氧条件下能量消耗主要依赖于葡萄糖所致。因此，若要阐明能量对犬卵母细胞成熟作用，还需从分子水平深入研究。

1.6 培养密度

T Otoi等研究培养密度对犬卵母细胞成熟能力影响[10]，发现不同密度下卵母细胞减数分裂能力与供体所处生殖周期有关。发情后期卵巢中卵母细胞在一定体积（100μL）液滴中培养时，10枚/100μL组发育至MⅡ比例（16.2%）比例显著（P＜0.05）高于5枚/100μL（4.6%）及其它组。在间情期组，10枚/100μL，15枚 /100μL发育至 MⅡ比例分别为10.4%和11.3%，而两者间差异不显著，但都高于其它组。表明培养液滴体积相同条件下，卵母细胞成熟能力与生殖周期有关。另外实验比较了相同培养密度和不同培养液滴体积条件下卵母细胞成熟能力大小。发现发情后期卵巢卵母细胞组中，10枚/100μL组发育至MⅡ比例（10.4%）高于1枚/10μL和5枚/50μL组，但都差异不显著。而在间情期组中，各组发育至MⅡ比例皆在10%左右，差异不显著。表明在培养密度相同条件下，培养液滴体积大小不影响发情后期和间情期卵巢卵母细胞体外成熟能力。所以，下步实验需要阐明培养液滴密度和体积是如何影响不同发情周期卵母细胞成熟能力。

1.7 温度

截止目前，犬卵母细胞体外成熟多采用37℃[12，28]，38.5℃[12，30，51]和 39℃[25，52，53]。但无研究比较不同温度下犬卵母细胞体外成熟能力大小。

仅有研究比较不同温度下犬卵母细胞活性大小。H SLee等比较了4℃和38℃时卵母细胞活性[54]。发现保存（0 h），4℃与38℃活性差异不显著（79.6%∶83.9%）。保存24 h，4℃下活性（13.2%）显著小于38℃下的活性（77.8%）（P＜0.05）。保存 48 h后，4℃下卵母细胞活性为0，显著（P＜0.05）小于 38℃（72.9%）。此研究表明，犬卵母细胞对温度很敏感。而Bolamba等报道腔前卵泡中卵母细胞在4℃下保存，48h（36.4%）和 72h（44.4%）组间退化率差异不显著[55]。上述不同研究结果可能与以下因素有关：（1）冷冻液体不同；（2）染色方法不同；（3）判断标准不同。在别的物种中，如EcEvoy TG等认为猪卵母细胞对低温敏感，主要是由于猪卵母细胞中含有高浓度脂肪滴及与所含有的细胞膜成分[56]。他们发现卵丘包裹的GV期卵母细胞在低于等于15℃下不能存活[57]。犬卵母细胞中亦含有高浓度脂肪滴，在低温条件下，犬卵母细胞质膜中由于脂质损害而降低犬卵母细胞活性。

1.8 各种因子

1.8.1 减数分裂抑制因子

N Songsasen等研究发现减数分裂抑制剂roscovitine不能显著抑制犬卵母细胞减数分裂能力[23]，其中25 μmol/L roscovitine处理24 h 60%卵母细胞（共56枚卵母细胞）处于生发泡期（GV期），与对照组（不添加roscovitine）比较差异不显著。同时研究发现dbcAMP显著（P＜0.05）抑制犬卵母细胞减数分裂恢复能力，并且呈剂量依赖式。其中犬卵母细胞在5 mmol/L，10 mmol/L dbcAMP中作用24 h，分别有65%（共51枚卵母细胞）和54%（共63枚卵母细胞）卵母细胞处于生发泡期，显著（P＜0.05）高于对照组（不添加dbcAMP的23.8%）。实验同时发现dbcAMP处理24 h犬卵母细胞产生的抑制效应是可逆的，犬卵母细胞在dbcAMP中处理24 h，然后在无dbcAMP中作用48 h，其发育至MⅡ比例与无dbcAMP组相同。此结论与小鼠及猪卵母细胞是一致的[58，59]。

1.8.2 生长激素

Berenice de Avila Rodrigues等分别比较TCM199成熟液中添加1μg/mL雌二醇，20 μg/mL雌二醇和1μg/mL人生长激素对犬卵母细胞成熟作用，发现两组间卵母细胞体外成熟72 h发育至MⅠ/MⅡ比例差异不显著（14.1%∶10.2%）[26]。但实验没有比较雌二醇和人生长激素单独作用对犬卵母细胞成熟的作用。

1.8.3 β-巯基乙醇和EGF

β-巯基乙醇（β-ME）和表皮生长因子（EGF）通过合成谷胱甘肽（GSH）保护卵母细胞和胚胎免受氧化反应所致损害。已发现EGF能促进人、牛、猪和啮齿类动物卵母细胞体外成熟能力。KimMK等研究β-ME和EGF对不同发情期犬卵母细胞体外成熟作用[60]。结果发现添加50 mmol/L或100 mmol/L β-ME能显著促进卵泡期卵母细胞发育至MⅡ能力。与其它发情周期卵母细胞相比，25 mmol/L或100 mmol/Lβ-ME能显著促进卵泡期卵母细胞发育至MⅠ能力。另外，与其它发情周期卵母细胞相比，20 ng/mLEGF能显著促进卵泡期卵母细胞发育至MⅡ能力。因此，β-ME和EGF对犬卵母细胞成熟作用依赖于发情周期。未来需要进一步研究β-巯基乙醇和表皮生长因子是如何促进卵泡期卵母细胞发育能力，为优化犬卵母细胞体外成熟体系作参考。

1.9 体内来源卵母细胞

SYamada等对比格犬进行超数排卵[2]，发现从卵巢中抽吸获取的卵母细胞都处于生发泡期（GV）。当卵母细胞体外成熟24 h，9.1%卵母细胞发育至MⅡ。当体外成熟48 h，卵丘细胞开始扩展，27.3%发育至MⅡ。而培养时间延长至72 h，高达31.9%卵母细胞发育至MⅡ，并且卵丘细胞持续扩展。此研究表明，体内来源的卵母细胞核成熟能力与卵丘细胞扩展成正比。但作者没有报道卵母细胞体外发育72 h的发育能力。建议在此实验基础上延长体外成熟时间，检测卵母细胞最大发育潜能。另外，需要比较相同培养条件下体内和体外卵母细胞成熟能力大小。

2 新培养方法

为了模拟犬卵母细胞体内成熟过程，有较多研究采用细胞共培养（包括胚胎成纤维细胞、颗粒细胞、输卵管上皮细胞），输卵管液共培养及结扎输卵管共培养以期望进一步提高卵母细胞体外成熟效率。

2.1 细胞共培养

2.1.1 胚胎成纤维细胞

S Hatoya等研究了小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）和犬胚胎成纤维细胞（CEF）对犬卵母细胞体外成熟（IVM）、体外受精（IVF）和体外胚胎发育（IVC）的影响。发现CEF能促进犬卵母细胞体外发育至16-细胞，MEF能促进犬卵母细胞发育至桑椹胚[51]。表明胚胎成纤维细胞（MEF，CEF）能够促进犬卵母细胞核成熟和细胞质成熟。

2.1.2 颗粒细胞和犬肾细胞

MPtaszynska研究了牛颗粒细胞和犬肾细胞对犬卵母细胞成熟的作用，结果表明牛颗粒细胞和犬肾细胞都能促进犬卵母细胞体外成熟。

2.1.3 输卵管上皮细胞

Camila Infantosi Vannucchi等研究犬输卵管上皮细胞对卵母细胞核成熟作用[53]。在成熟液添加20 μg/mL雌二醇时，卵母细胞成熟96 h仅有5.2%发育至MⅡ，其它组更少比例发育至MⅡ期，此培养体系需要优化。另外发现培养液中添加孕酮能降低卵母细胞退化率（孕酮组：17.1%～25%；无孕酮组：42.3%～76.7%）。此实验所取样本量少，如每组实验所取卵母细胞24～67枚，此结论需进一步证实。

2.1.4 人工合成输卵管液（SOF）

D A Hewitt研究人工合成输卵管液（SOF）对犬卵母细胞成熟作用[61]。发现培养液中添加SOF，卵母细胞成熟48 h并不能促进减数分裂恢复（GVBD）（SOF+0.3%BSA组:45%；SOF+4%BSA组:36%；medium 199组:27%）和核成熟（MⅠ/AⅠ/MⅡ，SOF+0.3%BSA组:5%；SOF+4%BSA组:7%；对照199组:6%）。同时，在SOF液中添加低浓度牛血清白蛋白（0.3%BSA）不能促进核成熟，而在SOF液中添加高浓度牛血清白蛋白（4%BSA）能促进核成熟。此原因需要进一步研究。在SOF液中添加低浓度牛血清白蛋白（0.3%BSA组:27%），卵母细胞体外成熟96 h核成熟能力受抑制，而对照组（63%）或SOF液添加高浓度BSA组（4%BSA组:62%）能促进核成熟能力。牛血清白蛋白对犬卵母细胞成熟的作用可能与SOF成分有关。

2.2 结扎输卵管共培养

为了模拟体内卵母细胞成熟发生在输卵管的过程。Luvoni G C等研究分离出的输卵管共培养对犬卵母细胞成熟作用[62]。发现卵母细胞与结扎输卵管共培养时，有12.5%～31.9%的卵母细胞发育至MⅠ/MⅡ。当卵母细胞与结扎输卵管共培养30 h，有63.8%卵母细胞恢复减数分裂，显著高于（P＜0.001）液滴培养组（20.4%）及开放输卵管组（27.1%）。随体外成熟时间延长，减数分裂恢复比例降低，体外成熟24 h（69.2%）和30 h（59.1%）减数分裂恢复比例显著高于48 h（35.8%）。另外，卵母细胞在输卵管中共培养时间延长至48h，卵母细胞退化比例（退化率：59.3%）显著高于体外培养24 h组（18.7%）和30 h组（27.3%）。较高的退化率原因不清楚。若通过降低退化率有可能进一步提高卵母细胞发育至MII能力。

2.3 二维培养方法

Fulton R等在1998年从犬卵巢组织中分离出早期有腔卵泡（EAN）和晚期腔前卵泡（APAN）。培养前在培养皿底铺满胶原，把卵泡放置在含TCM199成熟液中培养72 h，发现有较多比例卵母细胞（82/213，38.5%）发育至MⅡ[63]。表明犬卵泡中卵母细胞在二维培养体系中成熟能力较大。

2.4 卵泡培养方法

目前仅有一篇文章研究卵泡包被的卵母细胞放置于微滴中进行培养中[64]。他们首先在体外分离出早期有腔卵泡（EAN）和晚期腔前卵泡（APAN）。发现体外分离出的卵泡中卵母细胞有少数已发育至MⅠ/MⅡ（APAN：0.9% ；EAN:0.9%），表明卵母细胞在卵巢中可以恢复减数分裂。为了保持卵泡三维结构，防止颗粒细胞损失，在培养皿底部铺满琼脂。发现卵泡包被的卵母细胞在此条件下体外成熟24 h，APAN（5.3%，20/374）中卵母细胞发育至MⅠ/MⅡ比例显著高于（P＜0.05）体外成熟 0 h组（0.9%，3/318），体外成熟 48 h发育至 MⅠ/MⅡ比例增大（P＜0.05）（11.5%，47/407），但成熟至72 h发育至MⅠ/MⅡ没有继续增加（9.9%，40/404）。而EAN体外成熟24 h卵母细胞发育至MⅠ/MⅡ比例增加不显著，而成熟至 48 h增加显著（8.7%，11/126）（P＜0.05），成熟至 72 h发育至MⅠ/MⅡ增加亦不显著（7.5%，8/106）。表明卵泡包被的卵母细胞（APAN，EAN）在培养起初阶段，核成熟能力随培养时间延长而增大。随培养时间延长，核成熟能力没有显著提高。

3 国内研究进展

目前，国内有关犬卵母细胞体外成熟研究不多[65，66]，成熟效率不高。潘和平研究培养温度对兰州土狗卵母细胞体外成熟的影响，发现37.0℃对COCs卵丘细胞扩展作用明显高于36.5℃，但此研究没有观察卵母细胞核相，其结论需进一步证实。叶华虎采集发情期和间情期犬卵巢中卵母细胞，发现发情期大于2 mm和1～2 mm腔前卵泡中卵母细胞体外成熟效率（MⅠ/AⅠ/MⅡ：42.5%，32.5%）显著高于间情期卵巢中卵母细胞（20.4%），并且卵丘扩展与卵母细胞成熟存在相关性。另外发现发情期犬血清能诱导卵丘扩展，但不能有效提高卵母细胞成熟效率。因此，需要更深入研究犬卵母细胞体外成熟机理，以提高体外成熟效率。

4 展望

鉴于目前仍没有找出优良的体外成熟体系，需要在前人研究基础上，采用先进的实验技术和新颖的实验思路，以优化体外成熟体系。如采用分子生物学方法，基因芯片原理和技术，二维蛋白电泳技术研究犬卵母细胞体外成熟机理。

5 致谢

感谢中国农业大学农业生物技术国家重点实验室张坤博士对本论文写作方面的帮助和建议。

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S829.2

B

1005-2739（2010）01-0001-08

2009-09-23

王伦学，男，博士，助理研究员。