HPLC法测定杯苋甾酮的血药浓度

266071 济南军区青岛第一疗养院第一疗养区 潘靖

川牛膝为苋科植物川牛膝(Cyathula officinalis Kuan)的干燥根，主产于四川、云南、贵州等地，具有逐瘀通经，通利关节，利尿通淋之功，用于胞衣不下、关节痹痛等[1]。其所含化合物类型主要有脂肪酸类、甾酮类、异黄酮类、齐墩果酸皂苷类化合物。根据近年来的文献报道，蜕皮甾酮有促进蛋白质同化作用、抗血小板聚集、降低血糖等明显的生理活性[2-3]，与川牛膝补肝益肾、强筋健骨功效相符。杯苋甾酮(Cyasterone)(图1)[4-5]在川牛膝中含量较大[6]，可作为代表性药物进行药物代谢动力学研究。因此本文建立高效液相色谱法测定杯苋甾酮的血药浓度为其进一步研究提供依据。

图1 杯苋甾酮的结构式

1 材料、仪器和动物

实验动物：大耳兔，体重2.0 kg，由湖州市药检所提供。实验前禁食24 h，自由饮水，室温饲养。仪器：Waters高效液相色谱仪(515泵、2487紫外检测器)，7725 i手动进样阀，针筒式微孔过滤器(0.45 μm，天津市腾达过滤器厂)，GR-202 AND分析天平，UV-754型紫外可见分光光度计，80-2台式离心机，XW-80 A涡流混旋器，BDS 160电热恒温水温箱。杭州英谱工作站，AS 3120 A超声仪。药品和试剂：对照品，自制，TLC及HPLC检测均为单峰。经过UV、IR、MS、1H-NMR、13C-NMR、CD等测试鉴定为杯苋甾酮，纯度为99.6%(HPLC-ELSD归一化法测定)。乙腈、甲醇为色谱纯；实验用水为重蒸去离子水。

2 方法

2.1 给药 采用灌胃法[7]给药，家兔称重2.0 kg，按家兔体重25 mg/kg给药。精密称取杯苋甾酮对照品50.0 mg，溶于10 mL蒸馏水中，超声成混悬液，吸于注射器中给药。用5 mL蒸馏水清洗注射器。给药前取血做空白血，给药后不同时间取血，HPLC法测定兔血浆中杯苋甾酮的含量。

2.2 血样处理 取兔耳缘静脉血，每次0.5 mL置于2 mL的真空采血管中(内含枸椽酸钠)，加入乙腈2 mL，涡流混旋10 min，4 000 r/min离心10 min，取上清液水浴蒸干，残渣加入0.1 mL流动相超声溶解，分别过膜，HPLC测定杯苋甾酮的峰面积，从标准曲线上获得杯苋甾酮的浓度。

2.3 对照品溶液制备 精密称取杯苋甾酮11.30 mg，置200 mL量瓶中，加50%甲醇水溶解并稀释至刻度，摇匀，得56.5 μg/mL。取上述对照品溶液5 mL于50 mL量瓶中，用50%甲醇水定容，摇匀，即得 (每1 mL中含杯苋甾酮5.65 μg)。

2.4 杯苋甾酮的紫外可见吸收光谱 取5.65 μg/mL的对照品溶液，以50%甲醇水作空白，在200～600 nm范围内扫描，得杯苋甾酮紫外可见吸收光谱，可知其在243 nm处有最大吸收。

2.5 数据处理 血药浓度和时间数据由3P87软件处理。

3 血液中杯苋甾酮的含量测定

3.1 测试条件 色谱柱为Symmetry-C18(5 μm，3.9 mm×150 mm)，流动相为乙腈20 g、水80 g、磷酸二氢钾1.36 g，流速1 mL/min，检测波长243 nm，进样量10 μL。柱温室温。

3.2 方法学考察

3.2.1 方法专属性考察 空白血液、含药血液样品和对照品按3.1项方法各进样10 μL，HPLC图谱(图2 A、B、C)。

图2 色谱图和线性图

3.2.2 稳定性考察 取处理好的血液样品，分别于 0 h、2 h、4 h、8 h、12 h 按项方法进样10 μL，计算杯苋甾酮的峰面积，RSD为2.32%，即样品在12 h内稳定性好。

3.2.3 线性关系考察 分别取空白血浆0.5 mL于5个试管中，分别加入杯苋甾酮对照品溶液，制成浓度分别为：0.565 μg/mL、1.130 μg/mL、2.260 μg/mL、4.520 μg/mL、9.040 μg/mL。按2.1项下血样处理过程处理后分别进样10 μL，3针/次，记录其峰面积。以杯苋甾酮峰面积(Y)为纵坐标，杯苋甾酮的进样浓度(X)为横坐标，由HS色谱数据工作站计算得杯苋甾酮回归方程为Y=17 715X＋759.517，r=0.999 0，在 0.565～9.040 μg/mL范围内，线性关系良好(图2 D)。

3.2.4 回收率和精密度试验 于空白血液中加入高、中、低3个不同浓度的杯苋甾酮对照品液，制备得到分别含杯苋甾酮浓度为 9.040、2.260、0.565 μg/mL血液样品，测定3个浓度血液中杯苋甾酮的回收率分别为：89.7%、90.2%、93.5%，平均回收率为91.1%，RSD=2.25%(n=5)，日内精密度RSD=±3.9%，日间精密度RSD=±7.3%。

图3 杯苋甾酮的血药浓度-时间曲线

4 结果与结论

家兔经口服给药后，杯苋甾酮在家兔体内吸收很快，20 min血液中可检出杯苋甾酮(图3)；HPLC法测定家兔血液中杯苋甾酮的浓度，分离度好，方法简便、灵敏，可用于杯苋甾酮的血药浓度测定和进一步进行药物代谢动力学研究。

5 讨论

1)血样的处理：作者先后采用多种蛋白沉淀方法，和多种萃取方法，包括甲醇、乙腈、丙酮、高氯酸、硫酸铵等方法。结果表明，杯苋甾酮提取率在乙腈、甲醇中较高，且在乙腈中提取较干净、无干扰。因此采用乙腈沉淀蛋白并提取，方法简单，提取率又高。

2)本文采用乙腈20 g、水80 g、磷酸二氢钠1.20 g作为流动相测定兔血浆中杯苋甾酮的浓度，杯苋甾酮的保留时间为14.4 min，平均回收率为85.5%。本方法操作省时、简便，精密度及重现性均较好[8-11]。

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[3]陈辛，杜德极.拔毒散中抗血小板聚集活性成分[J].中草药，1996，27(增刊)：63.

[4]Zhou R，Li B G，Zhang G L.Journal of Asian Natural Products Research[J].2005，7(3)：245-252.

[5] 陈幸，黎万寿，梁溢，等.川牛膝化学成分的鉴定[J].中草药，2004，35(9)：978-979.

[6]黎万寿，陈幸，王晓阳，等.川牛膝的品质研究[J].现代中药研究与实践，2003，17(4)：18-20.

[7]徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学[M].北京：人民卫生出版社，2002：1762.

[8]陈幸，黎万寿，崔红，等.酶高效液相色谱法测定独活寄生合剂中杯苋甾酮含量[J].中国医院药学杂志，2003，23(8)：451-452.

[9]黎万寿，陈幸，王晓阳，等.RP-HPLC法测定白毛夏枯草中杯苋甾酮的含量[J].中草药，2002，33(10)：898-899.

[10]马英，毕开顺，王玺，等.HPLC法测定川牛膝中杯苋甾酮的含量[J].中草药，2000，31(6)：427-428.

[11]陈幸，黎万寿，朱久武，等.RP-HPLC法测定川牛膝中杯苋甾酮的含量[J].药物分析杂志，2000，20(4)：234-235.